ما الذي تحدده طريقة if. ماذا تعني نتيجة ELISA الإيجابية (المقايسة المناعية الأنزيمية)؟

الترخيص الصيدلاني العام

قدم لأول مرة

تغطي دراسة دستور الأدوية العامة هذه طريقة المقايسة المناعية للإنزيم (ELISA). طريقة ELISA هي طريقة تشخيص مناعي عالية الحساسية وعالية التحديد ، يتم من خلالها إجراء التحديد النوعي والكمي للمواد المختلفة التي لها خصائص مستضد ، أو مستضد غير مكتمل أو جسم مضاد. تُستخدم طريقة ELISA على نطاق واسع لتشخيص الأمراض المعدية وغير المعدية في البشر والحيوانات ويمكن أيضًا استخدامها لتأكيد جودة علم المناعة. الأدوية(ILP).

يتكون مبدأ الطريقة من تفاعل التفاعل المحدد للمستضد مع الجسم المضاد مع تكوين مركب مناعي والاكتشاف اللاحق للمركب الناتج باستخدام القياس الطيفي والتلألؤ الكيميائي وطرق أخرى مناسبة. يمكن أن يكون الاكتشاف مباشرًا (عندما يكون لمادة الاختبار نفسها نشاط إنزيمي ، أو يتم تمييزها بملصق إنزيم) ، وغير مباشر أو غير مباشر (عندما يتم تحضين مادة الاختبار المرتبطة بالأجسام المضادة المثبتة في المرحلة الصلبة بأجسام مضادة موصوفة بالإنزيم ). يسمح لك التحليل النوعي بالحصول على معلومات حول محتوى مستضد أو جسم مضاد في مادة الاختبار وفقًا لمبدأ "نعم / لا". عند إجراء تحليل كمي ، يتم تحديد تركيز المستضد أو الجسم المضاد في مادة الاختبار باستخدام منحنى المعايرة.

الأحكام العامة

تشتمل طريقة ELISA على ثلاث مراحل رئيسية: 1) تكوين مركب مناعي "مستضد (مادة اختبار) - جسم مضاد خاص به" أو العكس ؛ 2) تكوين رابطة مترافقة مع المركب المناعي المتكون في المرحلة السابقة أو مع مواقع الارتباط الحرة (المحددات) ؛ 3) تحويل الركيزة تحت تأثير ملصق إنزيم إلى إشارة مسجلة نتيجة تفاعل كيميائي حيوي.

يتم تصنيف جميع طرق إجراء المقايسة المناعية للإنزيم على أنها متجانسة أو غير متجانسة.

التقنيات التي تحدث فيها جميع المراحل الثلاث من ELISA في محلول ، وبين المراحل الرئيسية لا توجد خطوات إضافية لفصل المجمعات المناعية المشكلة عن المكونات غير المتفاعلة ، تنتمي إلى مجموعة طرق ELISA المتجانسة. أساس ELISA المتجانس ، والذي يستخدم عادة لتحديد المواد ذات الوزن الجزيئي المنخفض ، هو عملية تثبيط نشاط الإنزيم عندما يتم دمجه مع مستضد أو جسم مضاد. نتيجة لتفاعل المستضد مع الجسم المضاد ، يتم استعادة نشاط الإنزيم. عندما يتم تكوين مركب مناعي ضد الجسم المضاد يحتوي على ملصق إنزيم ، يتم تثبيط نشاط الإنزيم بنسبة 95٪ فيما يتعلق بوزن جزيئي عالي الركيزة ، والذي يرجع إلى الاستبعاد الفراغي للركيزة من المركز النشط للإنزيم. مع زيادة تركيز المستضد ، يرتبط المزيد والمزيد من الأجسام المضادة ، ويتم الاحتفاظ بالمزيد والمزيد من اتحادات إنزيم المستضد الحرة التي يمكن أن تحلل الركيزة عالية الوزن الجزيئي. طريقة ELISA المتجانسة سريعة جدًا. يستغرق تحليل تعريف واحد دقيقة واحدة. حساسية الطريقة عالية جدًا. مع ذلك ، يمكنك تحديد المادة على مستوى البيكومولات.

بالنسبة للطرق غير المتجانسة ، من المعتاد إجراء تحليل في نظام من مرحلتين بمشاركة مرحلة صلبة - الناقل ومرحلة فصل المجمعات المناعية عن المكونات غير المتفاعلة (الغسيل) الموجودة في مراحل مختلفة (المناعة الناتجة المجمعات في المرحلة الصلبة ، والمجمعات غير المتفاعلة في المحلول) إلزامية. تسمى الطرق غير المتجانسة ، التي يتم فيها تكوين المجمعات المناعية في المرحلة الأولى على المرحلة الصلبة ، بطرق المرحلة الصلبة.

يتم تصنيف الطرق على أنها متجانسة وغير متجانسة إذا كانت المرحلة الأولى - تكوين معقدات محددة - تحدث في محلول ، ثم يتم استخدام مرحلة صلبة مع كاشف غير متحرك لفصل المكونات.

تتكون طريقة ELISA غير المتجانسة من 3 خطوات رئيسية:

• تجميد مستضد أو جسم مضاد على طور صلب ، يسمى المركب الناتج مادة ماصة مناعية ؛
• إزالة الكاشف غير المرتبط وسد مواقع الربط على الدعم الصلب ببروتينات مانعة مثل ، على سبيل المثال ، الألبومين ، والكازين ؛ حضانة المستحضر الذي تم تحليله باستخدام مادة ماصة مناعية من أجل حدوث ارتباطها ؛

3) الكشف بسبب النشاط الأنزيمي لمادة الاختبار نفسها أو بسبب الملصق الإنزيمي المرتبط بالمستحضر الذي تم تحليله (البديل المباشر). في بعض الحالات ، يتم إجراء حضانة إضافية لمركب "مادة الاختبار المناعي" بأجسام مضادة ثانوية مقترنة بعلامة إنزيمية (متغير غير مباشر).

يتم التحديد الكمي للمادة التحليلية عن طريق إضافة ركيزة مناسبة للكاشف المستخدم ومقارنة إشارة المادة التحليلية بعينة قياسية.

تنقسم طريقة ELISA غير المتجانسة إلى ELISA غير التنافسية و ELISA التنافسي. يمكن تعديل مخططات الفحص أثناء تطوير منتج طبي وفقًا للمتطلبات الضرورية. يجب الإشارة إلى التغييرات في الدراسة أو الوثائق المعيارية. يعتمد اختيار طريقة ELISA على طبيعة مادة الاختبار ومقدارها ، منذ ذلك الحين أنواع مختلفةإليسا لها حساسيات مختلفة. لتقييم جودة المواد التي تحتوي على أجسام مضادة ، من الممكن استخدام أجسام مضادة محددة ذاتية.

طريقة ELISA غير التنافسية

تنقسم طريقة ELISA غير التنافسية إلى عدة أنواع وفقًا لنوع الاكتشاف (تنافسي مباشر ، تنافسي غير مباشر (غير مباشر)) ونوع المادة المجمدة في المرحلة الصلبة (مستضد أو جسم مضاد).

إليسا المباشر

يمكن القيام به بطريقتين. في الحالة الأولى ، يتم تثبيت مادة الاختبار (المستضد) مباشرة في المرحلة الصلبة ؛ ثم يكون الجسم المضاد المرتبط بالمستضد هو الكاشف. عند إجراء الاختبار بطريقة مختلفة ، يتم استخدام الأجسام المضادة المثبتة في المرحلة الصلبة. في هذه الحالة ، يكون الكاشف هو مادة الاختبار التي تحمل الإنزيم.

متغير ELISA غير المباشر (غير المباشر)

عند إجراء متغير غير مباشر من ELISA ، يتم تجميد المستضد في المرحلة الصلبة. بعد الحجب ، يضاف إلى المستضد محلول من الأجسام المضادة الخاصة به. بعد الحضانة ، يتم غسل معقد الأجسام المضادة الناتجة بعيدًا عن الأجسام المضادة غير المقيدة ويتم إضافة مضاد الغلوبولين المناعي المسمى بالإنزيم (مضاد Ig) ، والذي يعمل ككاشف. تتوفر أجهزة الكشف المضادة لـ Ig تجارياً لفئات Ig وفئات فرعية معينة ، مما يجعل تنسيق الفحص هذا مناسبًا للنمط المتماثل للأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام مضاد Ig المسمى يعزز الإشارة مقارنةً بـ ELISA المباشر ، وبالتالي يزيد من حساسية الفحص.

طريقة ساندويتش كمتغير من ELISA

الطريقة غير التنافسية الأكثر شيوعًا هي طريقة "الشطيرة". عندما يتم إجراؤها على المرحلة الصلبة ، يتم تجميد الأجسام المضادة الأولية مع منعها اللاحق. ثم تضاف إليها مادة الاختبار المحتوية على المستضد وتحضينها. بعد الحضانة ، يتم غسل معقد الجسم المضاد - المستضد بعيدًا عن المستضد غير المرتبط ، تتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية الموصوفة بالإنزيم ، ويتم إجراء الكشف.

طريقة ELISA التنافسية

تنقسم طريقة ELISA التنافسية إلى عدة أنواع: وفقًا لنوع الاكتشاف (تنافسي مباشر ، تنافسي غير مباشر (غير مباشر)) ووفقًا لنوع المادة المجمدة في المرحلة الصلبة (مستضد أو جسم مضاد).

ELISA تنافسية مباشرة

لاكتشاف أو تحديد المستضدات القابلة للذوبان ، يتم استخدام ELISA تنافسي مباشر مع مستضد مثبت في المرحلة الصلبة. للقيام بذلك ، استخدم الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد المقترنة بكاشف مناسب (على سبيل المثال ، بيروكسيداز الفجل ، الفوسفاتيز القلويةوالروثينيوم أو الفلورسين). يتم تجميد المستضد القياسي على الطور الصلب ، متبوعًا بالحجب. يتم تحضين الجسم المضاد المسمى بالإنزيم مع مادة الاختبار (مستضد قابل للذوبان). ثم يضاف هذا الخليط إلى مولد الضد الثابت ، ويحتضن ، ثم يغسل من معقد الأجسام المضادة غير المرتبط بالمستضد. الخطوة التالية هي إضافة الركيزة المناسبة للإنزيم المسمى. إن تثبيط التفاعل بسبب وجود مستضدين في النظام ، مقارنة بعينة تحكم بدون مستضد قابل للذوبان تنافسي ، يتناسب عكسياً مع قيمة كمية مادة الاختبار.

إجراء ELISA تنافسي مباشر مع جسم مضاد مثبت على مرحلة صلبة يشبه ELISA تنافسي مباشر مع مستضد ثابت في مرحلة صلبة ، ولكن يتم استخدامه لاكتشاف أو تحديد الأجسام المضادة.

ELISA تنافسية غير مباشرة (غير مباشرة)

تتشابه طريقة ELISA هذه مع المتغير التنافسي المباشر ، ومع ذلك ، بدلاً من الجسم المضاد المسمى أو مولد الضد ، يتم استخدام كاشف مضاد لـ Ig أو الأجسام المضادة الثانوية المصنفة للكشف ، على التوالي.

الشروط العامة للطريقةإليسا

يتم استخدام مواد مختلفة كمرحلة صلبة للمقايسة المناعية للإنزيم: سيليكون ، نيتروسليلوز ، بولي أميد ، بوليسترين ، بولي فينيل كلوريد ، بولي بروبيلين ، أكريليك وغيرها. يمكن أن تكون المرحلة الصلبة عبارة عن جدران أنبوب اختبار ، 96 بئرًا وألواحًا وكرات وخرزًا أخرى ، بالإضافة إلى النيتروسليلوز والأغشية الأخرى التي تمتص البروتينات بنشاط. يعتمد مبدأ التثبيت (كاره للماء ، الماء ، التفاعل التساهمي) على اختيار المرحلة الصلبة. الطور الصلب الأكثر شيوعًا هو 96 طبقًا ميكروتيترًا بلاستيكيًا جيدًا. قد يختلف عدد الآبار في اللوحة. يمكن أن تكون اللوحة شفافة (الكشف اللوني) ومعتمة (الكشف عن الإشعاع الكيميائي ، قياس التألق).

يجب أن يتم التثبيت بدون فقاعات هواء في البئر ، لأن وجودها يغير قراءة الكثافة البصرية. من الممكن استخدام الكواشف المعطلة حيوياً. في هذه الحالة ، يتم استخدام الستربتافيدين وعلامة إنزيم بيوتينيلاتيد في التفاعل. تستخدم هذه الطريقة لتضخيم الإشارة. يجب الإشارة إلى وقت ودرجة حرارة التثبيت ، اعتمادًا على الطبيعة الحركية واستقرار وتركيز الكاشف ، في الدراسة والوثائق المعيارية.

يجب أيضًا الإشارة إلى جميع مراحل المقايسة المناعية للإنزيم ، ومحاليل الغسل والعرقلة ، والفترات الزمنية وظروف درجة الحرارة لكل مرحلة ، وعدد الدورات في الدقيقة للحضانة على شاكر ، وظروف الكشف في الدراسة والتوثيق التنظيمي.

أمثلة على طرق بعض أنواع ELISA

طريقة ELISA غير المباشرة غير التنافسية

1. امتصاص المستضد.يضاف 0.1-0.5 ميكروغرام من المستضد و 100 ميكرولتر من محلول عازل كربونات-بيكربونات 0.05 مولار (الرقم الهيدروجيني 9.6) إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر ، ما لم يُذكر خلاف ذلك في الدراسة أو الوثائق المعيارية ، ثم الامتصاص عند درجة حرارة تبلغ 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة يمكن استخدام محاليل عازلة أخرى ذات قيم عالية للأس الهيدروجيني. تتم عملية التفريخ عن طريق الاهتزاز على شاكر ذو صفيحة أفقية.

يتم غسل (مزدوج) جزيئات المستضد غير المقيدة بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 9.0) يحتوي على 0.1٪ توين -20 (300 ميكرولتر لكل بئر) ، ما لم يُذكر خلاف ذلك في دراسة دستور الأدوية أو الوثائق التنظيمية.

1. المنع.لمنع مواقع الارتباط غير المحدد لمولدات المضادات أو الأجسام المضادة ، يتم ملء آبار الصفيحة بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 9.0) أو محلول منظم آخر محدد في دراسة الأدوية أو في الوثائق التنظيمية التي تحتوي على محلول 1٪ من الألبومين المصل البقري أو البروتينات الأخرى (الكازين ، الجيلاتين ، الحليب المجفف ، إلخ) ، ويتم تحضينها لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما لم يرد خلاف ذلك في الدراسة أو الوثائق المعيارية).

ثالثا. معايرة أجسام مضادة محددة.إذا كان القياس الكمي مطلوبًا ، يتم معايرة مادة الاختبار (مستضد أو جسم مضاد) في التخفيفات التسلسلية بالتوازي مع العينة القياسية (RS).

يمكن إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي في كل من الصفوف الأفقية والرأسية للوحة. وتجدر الإشارة إلى أنه يتم إجراء معايرة الأجسام المضادة إذا كان من الضروري اختيار التركيز الأمثل للأجسام المضادة أو تحديد عيارها. في حالة تحديد التركيز الأمثل و / أو عيار الأجسام المضادة ، يتم استخدام التخفيف الموصى به لهذه الأجسام المضادة (المصل).

عند المعايرة ، يتم إدخال تخفيف جاهز للأجسام المضادة في البئر الأول من الصف - بمعدل 1-10 ميكروغرام لكل بئر ، ثم يتم إجراء تخفيف متسلسل للأجسام المضادة في الآبار. يتم إجراء الحضانة بأجسام مضادة محددة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزازها على شاكر لوحة أفقية.

يتم الغسيل على الأقل 3-4 مرات باستخدام محلول ملحي مخزّن بالفوسفات بدرجة حموضة 9.0 تحتوي على 0.1٪ توين -20.

1. إضافة مضادات الأنواع (مضاد الغلوبولين) مترافق مع ملصق إنزيم.تُستخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للأنواع المقترنة بعلامة إنزيمية كأجسام مضادة (ثانوية) للكشف. في أغلب الأحيان ، يتم استخدام الأجسام المضادة للماعز أو الأرانب ، خاصة بالجزيء بأكمله أو لشظايا Fc من أجسام مضادة معينة. عادة ما تشير الشركة المصنعة إلى تركيز الأجسام المضادة للكاشف كتخفيف لمحلول المخزون (على سبيل المثال ، 1: 1000).

يتم إجراء الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية المسمى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز على شاكر لوح أفقي.

يتم الغسل على الأقل 3-4 مرات باستخدام محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 9.0) يحتوي على 0.1٪ توين -20.

تتم الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتهتز على لوحة شاكر أفقية.

1. يضاف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى الآبار ويحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب المستمر. لإيقاف التفاعل الأنزيمي ، يتم استخدام "كاشف توقف" ، والذي يضاف إلى جميع عينات الاختبار والمراقبة بكميات متساوية. في أغلب الأحيان ، يستخدم حمض الكبريتيك كـ "كاشف توقف".

مباشر غير تنافسي طريقة إليسا

طريقة ELISA المباشر لها اختلافات طفيفة فقط من طريقة ELISA غير المباشرة غير التنافسية. وبالتالي ، فإن المرحلتين الأولى والثانية هي نفسها في كلا النوعين من التحليل. يكمن الاختلاف في حقيقة أنه في الإصدار المباشر من ELISA في المرحلة الثالثة ، يتم استخدام أجسام مضادة خاصة بمولد الضد الاختباري ، مترافقة مع ملصق إنزيم ، وتتفاعل مباشرة مع مادة الاختبار. إذا لزم الأمر ، من الممكن أيضًا معايرة الاتحادات بنفس الطريقة الموضحة سابقًا للأجسام المضادة غير المقترنة. لا يتم تنفيذ المرحلة الرابعة في إطار ELISA المباشر غير التنافسي.

طريقة "ساندويتش" إليسا

يستخدم هذا البديل من ELISA زوجًا من الأجسام المضادة (الأولية والثانوية) الخاصة بالحلقات البعيدة مكانيًا للمستضد قيد الدراسة.

1. امتصاص الأجسام المضادة في المرحلة الصلبة.تشبه طريقة امتصاص المستضد طريقة امتصاص الأجسام المضادة في قسم "ELISA غير المباشر وغير التنافسي".
2. المنع.تشبه تقنية حجب مواقع الربط غير المحددة على الركيزة (المرحلة الصلبة) تقنية الحجب الموصوفة في قسم "ELISA غير المباشر وغير التنافسي".

ثالثا. الحضانة مع المستضد.يتم إضافة 50 ميكرولتر من مادة الاختبار والتخفيفات المعيارية لمولد الضد إلى آبار الجهاز اللوحي مع الأجسام المضادة الممتصة مسبقًا ، ما لم يُذكر خلاف ذلك في الدراسة أو التوثيق المعياري. يجب تحضير تخفيفات المستضد بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (درجة الحموضة 9.0) يحتوي على 0.1٪ توين -20 ، حيث يقلل توين -20 الارتباط غير المحدد لجزيئات البروتين ببعضها البعض وبسطح اللوحة. تتم إضافة كل من مادة الاختبار والتخفيفات القياسية للمستضد في أزواج إلى الآبار المجاورة في صف أفقي (أو 3 مكررات) ، باستخدام 2 (3) بئرين لكل تخفيف بروتين.

تتم الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع التقليب المستمر. يتم الغسل 3-4 مرات على الأقل بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 9.0) يحتوي على 0.1٪ توين -20 ، أو محلول عازل آخر محدد في الدراسة أو الوثائق التنظيمية.

1. الحضانة بالأجسام المضادة التي تحمل علامات الإنزيم.تتم إضافة 100 ميكرولتر من محلول أجسام مضادة محددة مترافق مع ملصق إنزيم إلى آبار الجهاز اللوحي. يشار إلى التركيز الأمثل للأجسام المضادة المقترنة ، كقاعدة عامة ، في الدراسة أو الوثائق التنظيمية (عادةً ما يتم استخدام تركيز 2-4 ميكروغرام / مل).

يتم إجراء الحضانة بالأجسام المضادة التي تحمل علامات الإنزيم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزازها على شاكر لوح أفقي.

يتم الغسيل على الأقل 3-4 مرات باستخدام محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 9.0) يحتوي على 0.1٪ توين -20 ، أو محلول منظم آخر محدد في الدراسة أو الوثائق التنظيمية.

1. إجراء تفاعل إنزيمي مصحوب بظهور منتج ملون.إجراء تنفيذ تفاعل إنزيمي مشابه للإجراء الموصوف في القسم: "طريقة ELISA غير المباشرة وغير التنافسية".

كشف

كما هو مذكور أعلاه ، يتم استخدام الأجسام المضادة التي تحمل ملصق إنزيم أو كاشف آخر للكشف. يمكن أن تكون تسمية الإنزيم ، على سبيل المثال ، الفجل البيروكسيديز أو الفوسفاتاز القلوي أو الجالاكتوزيداز. يمكن استخدام الأجسام المضادة أو المستضدات التي تحمل ملصقات أخرى ككاشف. يعتمد اختيار كاشف الكشف على نوع الملصق المترافق مع الجسم المضاد أو المستضد وطريقة الكشف.

كطرق للكشف ، يمكن استخدام القياس الطيفي والتلألؤ الكيميائي وقياس التألق وطرق أخرى ، بناءً على اختيار الملصق.

نتائج طريقة الاليزا الكمي

يتم حساب نتائج طريقة ELISA الكمية من منحنى معايرة خطي مع انحدار عكسي أو باستخدام طريقة معقدة باستخدام منحنى معايرة غير خطي مع انحدار عكسي. تعتمد طريقة تفسير النتائج على الطريقة المستخدمة لضبط ELISA. على سبيل المثال ، من نتائج الاختبار باستخدام منحنى المعايرة ، يمكنك تقييم تركيز عينة غير معروفة ، وتقييم تركيز نصف الحد الأقصى للتثبيط أو التركيز الفعال. يتيح لك ذلك تحديد كمية مادة الاختبار أو نشاطها مقارنةً بمعيار المرجع / المعايرة (RS). عادة ، يعتمد شكل منحنى المعايرة عند تنفيذ طريقة ELISA الكمية ، والتي تميز تركيز الدواء الذي تم تحليله ، على متوسط ​​القيمة المحسوبة غير الخطية. في هذا الصدد ، يوصى باستخدام نماذج رياضية مختلفة لتحليل المنحنى الذي تم الحصول عليه. في حالات أخرى ، يتم استخدام طريقة ELISA كطريقة نوعية لتقييم وجود مادة اختبار معينة في العينة ضمن حساسية الطريقة.

ملحوظة.

تحضير محلول عازل كربونات-بيكربونات (الرقم الهيدروجيني 9,6). يضاف 1.59 جم من كربونات الصوديوم (لا مائي) أو 4.29 جم من كربونات الصوديوم 10-مائي و 2.93 جم من بيكربونات الصوديوم إلى أسطوانة قياس بسعة 1000 مل ، مذابة في 800 مل من الماء النقي ، يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.6 ، يقلب ، ثم يوصل حجم المحلول إلى العلامة بالماء النقي ويخلط مرة أخرى.

(ELISA) هي طريقة لفحص الدم في المختبر ، تعتمد على البحث عن خلايا خاصة - أجسام مضادة لـ امراض عديدة. لا تسمح الطريقة بتحديد العامل الممرض فحسب ، بل تسمح أيضًا بتحديد المرحلة التي تكون فيها العملية المرضية. هذا الأخير مهم جدًا للتشخيص والعلاج الإضافي للمريض.

مزايا وعيوب الطريقة

بين الجميع الأساليب الحديثة ELISA التشخيصي هو الأكثر ابتكارًا ودقة تقنيًا. مزاياه الرئيسية هي:

1. القدرة على البحث عن جميع الأجسام المضادة الموجودة للأمراض المعدية في دم المريض.
2. توافر عالي لطريقة البحث. اليوم ، يمكن إجراء تحاليل ELISA بواسطة أي مختبر متوسط ​​الحجم.
3. خصوصية وحساسية الطريقة بنسبة 100٪ تقريبًا.
4. القدرة على البحث عن الأجسام المضادة والمستضدات وكذلك إنشاء المرحلة عملية مرضيةوتتبع دينامياتها بفضل مقارنة الكمية.

هذا العدد من المزايا مقارنة بالاختبارات الأخرى يلقي بظلاله على العيب الوحيد في التحليل: فهو قادر على اكتشاف الأجسام المضادة ، ولكن ليس العامل الممرض نفسه.

الشروط الأساسية لتقييم التحليل

لفهم ماهية تحليل ELISA ، وما هو وكيف يتم إجراؤه ، تحتاج إلى التعرف على المصطلحات الأساسية التي يستخدمها المتخصصون.

1. الجسم المضاد- بروتين تنتجه خلايا جهاز المناعة البشري (الخلايا الليمفاوية من النوع B). يستجيبون برد فعل محدد على ابتلاع عامل أو مادة أجنبية. اسم آخر للأجسام المضادة هو الغلوبولين المناعي ، وهي تنتمي إلى فئات مختلفة: A ، E ، M ، G. وهي تختلف عن بعضها البعض في الكتلة وسرعة الاستجابة ونصف العمر وعدد من الخصائص الأخرى. عادة ، يحتوي دم الإنسان بشكل رئيسي على الغلوبولين المناعي من الفئة G. وفي حالة حدوث أي عدوى ، تزداد كمية الغلوبولين المناعي A و M بشكل حاد ، وتشارك الغلوبولين المناعي E في تفاعلات الحساسية.
2. مولد المضاد- عامل أجنبي من أصل عضوي ووزن جزيئي مرتفع. غالبًا ما تكون مسببات الأمراض أو موادها النشطة بيولوجيًا.
3. مركب الأجسام المضادة للمستضد ، أو مركب المناعة ، هو مزيج مباشر من مادة غريبة وجلوبيولين مناعي ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية.

جوهر ونطاق الطريقة

غالبًا ما يكون لدى المرضى سؤال: تحليل ELISA ، ما هو ، كيف يتم إجراؤه وما الغرض منه؟ يمكنك التحدث عن الطريقة بطريقة يسهل الوصول إليها من خلال وصف مراحلها بإيجاز.

المرحلة التحضيرية. يستخدم طبيب المختبر لوحة خاصة بها 96 بئراً. يتم تطبيق مستضد من مسببات الأمراض المحددة على سطح كل بئر.

المرحلة 1يُسحب الدم ، ثم يوضع قطرة بعد قطرة على البئر. يبدأ البئر تفاعلًا بين المستضد والجسم المضاد في الدم.

المرحلة الثانيةفي البئر ، يكون التفاعل على قدم وساق مع تكوين مجمعات مناعية. نتيجة لذلك ، يتم تكوين مادة ذات لون معين. تعتمد شدة اللون على كمية الأجسام المضادة في دم المريض لكل مُمْرِض محدد.

المرحلة 3تقييم النتيجة عن طريق قياس الضوء. لهذا ، يتم استخدام جهاز خاص يسمى مقياس الطيف الضوئي. يقارن كثافة المادة في البئر وعينة التحكم. علاوة على ذلك ، يولد الجهاز نتيجة عن طريق التحليل الرياضي.

تقييم نتائج والغرض من ELISA

يعتمد تفسير النتيجة على عدة فروق دقيقة مهمة:

1. الكثافة البصرية للبئر.
2. الشركة المصنعة للوحة الآبار (أنظمة الاختبار).
3. المختبر الذي أجريت فيه الدراسة.

بالنظر إلى هذه الفروق الدقيقة ، يجب ألا تقارن أبدًا بين نتيجتين من أنظمة اختبار مختلفة أو من مختبرات مختلفة.

نقطة أخرى مهمة تؤثر على تحليل ELISA هي ما يسمى بشغف الأجسام المضادة. تحدد هذه المعلمة كمية المستضد ، وقوة الرابطة في مجمع الجسم المضاد للمستضد. يعتمد تعريفه على علاج المركب المناعي باليوريا من أجل حل الهياكل البروتينية. هذا يسمح لك بتدمير الروابط الضعيفة بين المستضد والجسم المضاد وترك الروابط القوية فقط. تكمن أهمية الدراسة في الشغف في حقيقة أنه يمكن استخدامها لمعرفة مدة الإصابة. هذه المعلومات مهمة للغاية لتشخيص النساء الحوامل.

يعمل اختبار الدم ELISA على:

1. للبحث عن مستضدات مختلفة لمسببات الأمراض.
2. لدراسة الخلفية الهرمونية.
3. لاختبار وجود مرض مناعي ذاتي.
4. لاكتشاف العلامات أمراض الأورام.

أصناف إليسا

يحتوي تحليل ELISA على الأصناف التالية:

1. غير مباشر.
2. مستقيم.
3. تنافسي.
4. طريقة الحجب.

ولكن في الواقع ، لا يتم استخدام سوى طريقة تسمى ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم) اليوم. يعتمد على التفاعل الموصوف أعلاه لتكوين مركب مضاد لجسم مضاد مع تغير لون سطح البئر.

يستحق اختبار الدم ELISA الكمي المباشر اهتمامًا خاصًا. هذا ليس نوعًا من التحليل ، ولكنه طريقة لتقييم النتائج. بفضله ، يتم حساب عدد الأجسام المضادة وتحديد فئاتها. تعتمد النتيجة على الكثافة البصرية للعينة ونظام الاختبار الذي تم إجراء اختبار ELISA عليه وكذلك على المختبر.

الأمراض التي تم الكشف عنها بواسطة ELISA

ELISA هو فحص دم يسمح لك بتحديد عدد كبير من الأمراض المعدية المختلفة. علاوة على ذلك ، يتم الكشف عن كل من الأمراض الفيروسية والبكتيرية بدقة متساوية. على سبيل المثال ، بمساعدة تكوين المجمعات المناعية ، من الممكن إثبات وجود مستضدات العوامل المسببة للأمراض التالية:

بالإضافة إلى ذلك ، تسمح لك ELISA باكتشاف:

1. علامات السرطان - TNF (عامل نخر الورم) ، PSA (مستضد البروستات النوعي) ، CEA (مستضد السرطان الجنيني) ، CA-125 (علامة ورم المبيض)
2. هرمون الحمل هو hCG (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية).
3. الانتهاكات الجهاز التناسلي: هرمونات الجهاز التناسلي للأنثى والذكور.
4. علم أمراض الغدة الدرقية.

من المهم الإشارة إلى أن اختبار ELISA لفيروس نقص المناعة البشرية اليوم هو الطريقة الرئيسية لتشخيص هذا المرض الخطير.

تقنية ELISA للمواد وأخذ العينات

لإجراء ELISA ، يتم أخذ دم المريض على معدة فارغة. علاوة على ذلك ، يتم الحصول على مصل الدم ، والذي يستخدم مباشرة للتحليل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء ELISA على السائل النخاعي (CSF) ، ومخاط قناة عنق الرحم (عنق الرحم) ، والسائل الأمنيوسي وحتى السائل الجسم الزجاجي(مقلة العين).

قبل التبرع بالدم يحذر المريض من تناول أي أدوية والعلاج بالمضادات الحيوية و الأدوية المضادة للفيروساتيوصى بإنهاء أسبوعين على الأقل قبل أخذ عينات الدم.

شروط استلام وتفسير النتائج

توقيت تلقي استجابة من المختبر لا يعتمد على سرعة عمله ، ولكن على مرحلة المرض وما هي الأجسام المضادة التي ظهرت بالفعل في الدم. لذلك ، على سبيل المثال: تظهر الجلوبيولين المناعي M بعد أسبوعين تقريبًا من أخذ الدم للتحليل ويعني أن العملية في مرحلة الإصابة الأولية أو حدوث تفاقم لعدوى مزمنة. في الوقت نفسه ، تظهر الأجسام المضادة من الفئتين M و G أثناء الإصابة الأولية. علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف الأخير بعد 4 أسابيع.

يظهر IgA بعد 2-3 أسابيع إما بمفرده أو مع M ، مما يشير إلى عدوى حادة ، أو مع G ، مما يشير إلى عملية مزمنة.

هذه تواريخ مختلفةظهور الأجسام المضادة في الدم سيجعل المريض ينتظر وقتا طويلا للنتيجة. من المقبول الانتظار أكثر من شهر بعد إجراء تحليل ELISA. يستغرق فك الشفرة والتفسير من قبل الطبيب أيضًا فترة زمنية معينة.

مع التقدم الطب الحديثمن الممكن إجراء المزيد من التشخيصات المتعمقة في حالة الاشتباه في بعض الأمراض لدى المريض. إحدى الطرق الإعلامية البحوث المخبريةكان تحليل ELISA ، الذي تم إجراؤه عن طريق أخذ الدم الوريدي. أي ، لا شيء يتغير بالنسبة للمريض ككل. لكن مساعد مختبر ELISA يجري تقنية معقدة لدراسة المواد الحيوية التي تم جمعها. ما هي تحليلات ELISA وما هي التفاصيل الدقيقة لاستخدام طريقة ELISA كأسلوب تشخيصي ، نحن نفهم المادة أدناه.

ما هو الإنزيم المناعي؟

يتم تحفيز إنتاج الأجسام المضادة بواسطة المستضدات نفسها التي دخلت جسم الإنسان. عند دخول "المعركة" من أجل صحة الجسم ، فإن الأجسام المضادة ، كما كانت ، تميز نفسها بالمستضدات ، وهو ما يراه مساعد المختبر في فحص الدم. وهذا يعني أنه في المادة الحيوية التي تم جمعها ، من الممكن تتبع ليس فقط وجود العدوى ، ولكن أيضًا آثارها بعد تعافي الجسم تمامًا.

وهكذا ، فإن التنازل مقايسة الممتز المناعي المرتبطالدم للمريض ، يمكن للطبيب المعالج تتبع مدة الإصابة ، ودرجة تطورها ، أو تحديد وجود مناعة ضد عدوى معينة.

تبدو عملية تشخيص ELISA كما يلي:

• يتم إحضار الدم الوريدي المأخوذ في المختبر إلى حالة مصل الدم ؛
• ثم يستخدم مساعد المختبر صينية خاصة بها خلايا ، يحتوي كل منها بالفعل على جميع المستضدات اللازمة. يكفي فقط إسقاط مصل الدم في كل خلية وتتبع تفاعل الغلوبولين المناعي (الأجسام المضادة) مع المستضدات. يشار إلى وجود التفاعل "المطلوب" من خلال تغيير لون المادة قيد الدراسة. في المستقبل ، يدرس مساعد المختبر الكثافة البصرية للوسيط قيد الدراسة.

• داء الصفر وداء الأمعاء (الديدان الأسطوانية والديدان الدبوسية) ؛
• مرض دودة الخنزير؛
• داء الفتق في الأشكال الحادة والمزمنة.
• داء الجيارديات.
• الأميبا.
• داء المقوسات.
• داء الليشمانيات بأي شكل.

هام: يمكن أن تكون المقايسة المناعية للإنزيم نوعيًا وكميًا. في الحالة الأولى ، يقوم مساعد المختبر فقط بتأكيد أو دحض وجود المادة المرغوبة في الدم. في الحالة الثانية ، نتيجة التحليل ، يشار إلى تركيزه في جسم المريض.

عيوب الطريقة

مع كل مزايا طريقة التشخيص هذه ، يجب أن يكون مفهوماً أن المقايسة المناعية للإنزيم ليست طريقة للعثور على سبب مرض المريض ، ولكنها مجرد طريقة لتأكيد التشخيص المزعوم من قبل الطبيب المعالج. وبالنظر إلى حقيقة أن الدراسة مكلفة للغاية ، فلا بد من استخدامها بحكمة. في هذه الحالة ، يجب تفسير نتائج الدراسة فقط من قبل متخصص مؤهل.

فك رموز النتائج

بعد أن قمنا بتفكيك الاختصار IFA وما هو ─ اكتشفت أن الأمر يستحق الانتقال إلى تفسير النتائج. من المهم أن نفهم هنا أنه إذا تم إجراء التحليل نوعيًا ، فستكون النتيجة إيجابية أو سلبية فقط. أي أن التشخيص إما يؤكد شكوك الطبيب حول تشخيص معين ، أو يدحضها. في هذه الحالة ، سيحتوي النموذج على الرموز "+" أو "-" ، على التوالي.

هام: نتيجة الاختبار السلبية لا تشير دائمًا إلى عدم وجود عدوى. الحقيقة هي أن الأجسام المضادة للمستضدات يمكن أن تتشكل في غضون 14 يومًا بعد الإصابة ومن المحتمل أنها لم تتشكل بعد.

إذا تم إجراء تحليل كمي ، فسيتم تحديد نوع الأجسام المضادة وعددها ومرحلة نشاطها هنا. على وجه الخصوص ، مع مثل هذا التشخيص ، يتم تحديد الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي) IgG و IgM ، والتي تتشكل في فترات مختلفة من تطور العدوى. النتائج الأكثر شيوعًا في هذه الحالة هي:

• IgM المرتفع والغياب التام لـ IgG. تشير هذه الصورة إلى إصابة حديثة ومرحلة حادة من علم الأمراض.
• زيادة نشاط كلا النوعين من الغلوبولين المناعي (IgM و IgG). يتحدث عن مسار طويل الأمد ومزمن للعملية المعدية.
• نشاط IgG والغياب التام لـ IgM. كانت العدوى قبل ستة أشهر على الأقل ، والفيروس الآن في مرحلة مزمنة مطولة.
• عدم وجود الأجسام المضادة IgG و IgA. النتيجة غير محددة.
• عدم وجود الأجسام المضادة IgM و IgA و IgG. يشير إلى نقص المناعة ضد عدوى معينة.
• يشير نشاط الأجسام المضادة IgG و IgM و IgA إلى تفاقم عملية مزمنة.

بالإضافة إلى تحديد أنواع الأجسام المضادة ، يشير مساعد المختبر في عمود خاص من النموذج أيضًا إلى عددها لكل حجم دم. تذكر ، بعد أن فهمت ماهية طريقة ELISA ، لا تفسر النتائج بنفسك. لا يمكن تفسير النتائج التي تم الحصول عليها بدقة إلا من قبل الطبيب المعالج ، اعتمادًا على التشخيص المقترح ، المبني على أساس الصورة السريريةعلى المريض.

في أغلب الأحيان في الممارسة العملية ، يتم استخدام ثلاثة أنواع من المقايسة المناعية في المرحلة الصلبة - المقايسة المناعية غير المباشرة والمقايسة المناعية المباشرة والمقايسة المناعية من نوع السندويتش. الاختلافات بين هذه الأنواع من المقايسات المناعية هي كما يلي. في النسخة غير المباشرة للمقايسة المناعية ، يُمتص المستضد على سطح آبار صفيحة البوليسترين في المرحلة الأولى. بعد إزالة جزيئات المستضد غير المرتبطة ، تتم إضافة عينة تحتوي على أجسام مضادة خاصة بذلك المستضد. يتم الكشف عن معقدات الأجسام المضادة الناتجة باستخدام الأجسام المضادة للأنواع المترافقة مع ملصق (الشكل 1 أ). في النسخة المباشرة للمقايسة المناعية ، يتم الكشف عن المستضد الممتز مباشرة بمساعدة أجسام مضادة محددة مقترنة بالملصق (الشكل 1 ب). في اختبار مناعي من نوع شطيرة ، في المرحلة الأولى ، لا يتم امتصاص المستضد على سطح الصفيحة ، ولكن الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد قيد الدراسة (الأجسام المضادة للركيزة). بعد إزالة جزيئات الجسم المضاد غير المرتبطة ، تتم إضافة عينة تحتوي على المستضد. لاكتشاف معقد الأجسام المضادة المكونة للركيزة - المستضد ، تتم إضافة الأجسام المضادة الثانية الخاصة بحلقة مستضد أخرى بعيدة مكانيًا ، مقترنة ببعض الملصقات (الشكل 1 ب). إن استخدام الأجسام المضادة من نوع الساندويتش الخاصة بنوعين مختلفين من حواتم مستضد في اختبار مناعي يجعل من الممكن تحقيق حساسية وخصوصية عالية في تحديد المستضد حتى في مثل هذه العينات غير المتجانسة مثل بلازما الدم.

أرز. 1. مبدأ المقايسة المناعية غير المباشرة (أ) والمباشرة (ب) والمقايسة المناعية من النوع الشطري (ج)

المقايسة المناعية للإنزيم غير المباشر (ELISA غير المباشر)

تتميز طريقة المقايسة المناعية غير المباشرة بتنفيذ عملية من 3 مراحل ، في المرحلة الأولى يتم امتصاص المستضد على بلاستيك مُعد خصيصًا ، وفي المرحلة الثانية تتفاعل الأجسام المضادة المحددة مع المستضد ، وفي المرحلة الثالثة تتفاعل الأجسام المضادة المحددة مع المستضد. - يتم إدخال أجسام مضادة في النظام مترافقة مع إنزيم يحدد مؤشر التفاعل الأنزيمي. في هذه الطريقة ، يتم استخدام بيروكسيداز الفجل باعتباره الإنزيم. يتم إجراء التفاعل في صفائح خاصة بها 96 بئر.

I. امتصاص المستضد

في آبار لوحة 96 بئراً للمقايسة المناعية ، تمتص مستضد 0.1-0.5 ميكروغرام لكل بئر في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). تتم الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتهتز على لوحة شاكر أفقية. يتم غسل (ضعفين) من جزيئات المستضد غير المرتبط بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات يحتوي على 0.1٪ توين -20 (PBST).

ثانيًا. الحجب

لمنع مواقع الربط غير المحددة ، تمتلئ آبار القرص بـ PBST وتحضن لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثالثا. تلطيخ أجسام مضادة معينة

يمكن إجراء الفرز في كل من الصفوف الأفقية والعمودية للكمبيوتر اللوحي. وتجدر الإشارة إلى أنه يتم إجراء عملية سحن الأجسام المضادة إذا كان من الضروري اختيار التركيز الأمثل للأجسام المضادة أو تحديد العيار. في حالة تحديد التركيز الأمثل و / أو عيار الأجسام المضادة ، يتم استخدام التخفيف الموصى به لهذه الأجسام المضادة المحددة.

عند السحن ، يتم إدخال تخفيف جاهز للأجسام المضادة في البئر الأول من الصف - بمعدل 1-10 ميكروغرام لكل بئر ، ثم يتم إجراء التخفيف المتسلسل للأجسام المضادة في الآبار. يتم إجراء الحضانة بأجسام مضادة محددة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتهتز على شاكر لوحة أفقية. يتم الغسيل بـ PBST 3 مرات.

رابعا. إضافة أجسام مضادة للأنواع مترافقة مع ملصق إنزيم

كأجسام مضادة كاشفية (ثانوية) ، يتم استخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للأنواع المترافقة مع بيروكسيداز الفجل. في أغلب الأحيان ، يتم استخدام الأجسام المضادة للماعز أو الأرانب ، خاصة بالجزيء بأكمله أو لشظايا Fc لأجسام مضادة معينة. عادة ما تشير الشركة المصنعة إلى تركيز الأجسام المضادة للكشف عن المخفف لمحلول المخزون (على سبيل المثال ، 1: 1000). يتم إجراء الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتهتز على شاكر لوحة أفقية. يتم الغسيل بـ PBST 5-6 مرات.

يحفز بيروكسيداز الفجل تفاعل أكسدة الركيزة مع بيروكسيد الهيدروجين. يستخدم O-phenylenediamine (OPD) كركيزة لبيروكسيداز الفجل. نتيجة للتفاعل ، يتم تكوين منتج أكسدة OPD ملون.

محلول الركيزة: يضاف إلى 10 مل من محلول الركيزة (0.1 مولار من محلول سترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 4.5) 0.01 مل من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين و 0.2 مل من محلول 50x OFD (340 مجم من OFD في 10 مل من الإيثانول ؛ يخزن في -20 درجة مئوية).

تتم الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتهتز على لوحة شاكر أفقية.

V. وقف التفاعل الأنزيمي

السادس. قياس الكثافة البصرية

المقايسة المناعية المباشرة للإنزيم (ELISA المباشر)

طريقة المقايسة المناعية المباشرة لها اختلافات طفيفة فقط مقارنة بطريقة المقايسة المناعية غير المباشرة. وبالتالي ، فإن الخطوتين الأولى والثانية هي نفسها في كلا نوعي التحليل. يكمن الاختلاف في حقيقة أنه في الإصدار المباشر من المرحلة الثالثة من المقايسة المناعية ، يتم استخدام أجسام مضادة محددة مقترنة بعلامة إنزيم. إذا لزم الأمر ، فمن الممكن أيضًا تنفيذ سحن أجسام مضادة محددة مقترنة بعلامة إنزيم ، على غرار ما تم وصفه سابقًا للأجسام المضادة غير المقترنة. تم حذف المرحلة الرابعة ، ويتم تنفيذ المراحل الأخرى (V-VII) بنفس الطريقة الموضحة أعلاه للمتغير غير المباشر للمقايسة المناعية.

المقايسة المناعية من نوع ساندويتش

أرز. 2. تمثيل تخطيطي للمقايسة المناعية من نوع "الساندويتش". ATp هو الجسم المضاد للركيزة ، ATd هو الجسم المضاد للكشف ، AG هو المستضد ، M هو الملصق المرتبط تساهميًا بالجسم المضاد للكشف ، P هو الركيزة التي يتم امتصاص الجسم المضاد للركيزة عليها.

في هذا المتغير من المقايسة المناعية (الشكل 2) ، يتم استخدام زوج من الأجسام المضادة الخاصة بالحلقات البعيدة مكانيًا للمستضد المدروس.

I. امتصاص الأجسام المضادة للركيزة

في آبار لوحة 96-بئراً للمقايسة المناعية ، تمتص الأجسام المضادة الركيزة 1-2 ميكروغرام لكل بئر في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). تتم الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتهتز على لوحة شاكر أفقية. يتم غسل (ضعفين) من جزيئات المستضد غير المرتبط بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات يحتوي على 0.1٪ توين -20 (PBST).

ثانيًا. الحجب

لمنع مواقع الربط غير المحددة ، تملأ الآبار بـ PBST وتحضن لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثالثا. الحضانة مع المستضد

في آبار الجهاز اللوحي مع الأجسام المضادة التي تم امتصاصها مسبقًا تساهم بـ 50 ميكرولتر من محلول الاختبار أو التخفيفات القياسية للمستضد. يجب تحضير تخفيفات المستضد من PBST لأن Tween-20 يقلل الارتباط غير المحدد لجزيئات البروتين ببعضها البعض وبسطح اللوحة. تتم إضافة كل من محلول الاختبار والتخفيفات القياسية للمستضد في أزواج (أو 3 مكررات) ، باستخدام بئرين (ثلاثة) لكل تخفيف بروتين. تتم الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع التقليب المستمر. يتم الغسيل بمحلول PBST 3 مرات.

رابعا. الحضانة بالأجسام المضادة التي تحمل علامات الإنزيم

تتم إضافة 100 ميكرولتر من محلول أجسام مضادة محددة مترافق مع ملصق إنزيم إلى آبار الجهاز اللوحي. عادة ما يتم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة المقترنة من قبل الشركة المصنعة (عادة ما يتم استخدام تركيز 2-4 ميكروغرام / مل). يتم إجراء الحضانة بالأجسام المضادة التي تحتوي على ملصق إنزيم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتهتز على هزاز لوحة أفقية. يتم الغسيل بـ PBST 5-6 مرات.

5. إجراء تفاعل إنزيمي مصحوب بظهور منتج ملون

يضاف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى الآبار ويحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب المستمر.

السادس. وقف التفاعل الأنزيمي

قبل قياس الكثافة الضوئية ، يتم إيقاف تفاعل اللون بـ 0.5 M · H 2 SO 4. بعد الحضانة ، يضاف 50 ميكرولتر من محلول حمض الكبريتيك 0.5 مولار إلى الآبار باستخدام محلول OFD العامل. بعد ذلك ، يمكنك البدء على الفور في قياس الكثافة البصرية.

سابعا. قياس الكثافة البصرية

يتم قياس الكثافة الضوئية لمحلول المنتج الملون عند λ = 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي اللوحي.

في قائمة المعيار تدابير التشخيصتستخدم للأمراض المعدية وتشمل المقايسة المناعية الإنزيمية. إذا كانت ELISA لمرض الزهري إيجابية ، فلا داعي للذعر على الفور.

دعونا نفكر بمزيد من التفصيل في ميزات منهجية البحث هذه ومبادئ فك رموز النتائج التي تم الحصول عليها فئات مختلفةمرضى.

إن المقايسة المناعية للإنزيم هي إحدى الطرق الأكثر شيوعًا لتشخيص الأمراض المعدية. إنه ينتمي إلى فئة اختبارات اللولب ، أي أنه يمكن استخدامه لتحديد وجود العامل المسبب لمرض الزهري في جسم المريض - الوذمة الشاحبة.

بواسطة ELISA ، يتم الكشف عن مرض الزهري بسبب اكتشاف الأجسام المضادة للالتهاب اللولبي. يتم احتواؤها في دم المريض ، ويعتمد نوعها وكميتها على مرحلة المرض وشكله ، مما يسمح لك بالإصابة به. معلومات مهمةحول الوضع الحالي لصحة الإنسان.

المميزات والعيوب

غالبًا ما يتم وصف ELISA لمرض الزهري المشتبه به أو غيره أمراض معدية. هذا يرجع إلى حقيقة أن التحليل يسمح لك بتحديد نوع ومرحلة المرض بدقة ، وتظل موثوقيته على مستوى عالٍ - احتمال الخطأ بناءً على نتائج دراسات متعددة هو 1 ٪ فقط ، ELISA الأساسي تبلغ دقته حوالي 90٪.

يتيح لنا استخدام الكواشف عالية الجودة والمعدات الحديثة زيادة دقة المؤشرات.

بشكل عام ، مزايا الطريقة هي:

1. دقة عالية للنتيجة. احتمال تلقي بيانات خاطئة ضئيل للغاية.
2. التقليل من عامل التأثير البشري.المعدات الحديثة لإجراء ELISA تستبعد التأثير البشري على نتائج الدراسة بسبب أتمتة العملية.
3. الكشف عن الأجسام المضادة المحددة. من المستحيل الخلط بين مستضدات من نوع ما مع مستضدات أخرى ، لذلك يظهر التحليل نتيجة دقيقة لتشخيص محدد.
4. إصلاح أدنى انحرافات عن القاعدة. حتى أصغر تركيز للعوامل المرضية لن يمر مرور الكرام.

لا تنسى نقاط الضعف في هذه الطريقة. ELISA لها العيوب التالية:

1. غالي السعر. ترجع التكلفة العالية إلى العديد من العوامل ، على وجه الخصوص ، الحاجة إلى معدات جيدة وكواشف عالية الجودة ومتخصصين بمستوى كافٍ من التدريب.
2. الحاجة إلى تشخيص أولي. تحتاج إلى معرفة المستضدات التي يجب البحث عنها ، لأنه بدون بيانات إضافية سيكون من المستحيل إجراء تشخيص دقيق.
3. احتمال وجود نتيجة إيجابية خاطئة. يمكن لبعض حالات الجسم وعوامل أخرى تشويه البيانات النهائية.

مؤشرات لتنفيذ

قد يصف الطبيب مقايسة مناعية إنزيمية ليس فقط لتشخيص مرض الزهري ، ولكن أيضًا لتشخيص عدد من الأمراض المعدية الأخرى.

إذا أخذنا في الاعتبار الموقف بشكل مباشر مع الإصابة بالتهاب اللولبية ، فقد يكون سبب الفحص:

• ظهور الأعراض الخارجية للمرض (القروح ، الطفح الجلدي الزهري ، الصمغ ، إلخ) ؛
• انخفاض كبير في المناعة.
• تحديد أو الاشتباه في مرض الزهري في الشريك الجنسي والأقارب وأفراد الأسرة ؛
• رد فعل إيجابي أثناء الاختبارات الأخرى ؛
• تحديد الأمراض الأخرى التي قد تترافق مع مرض الزهري ؛
• رغبة الشخص الشخصية في الفحص.

طرق التنفيذ

يمكن إجراء ELISA طرق مختلفة. في كل حالة ، يتم تحديد الخيار الأنسب.

بادئ ذي بدء ، هناك تقسيم للطرق إلى:

1. نوعي. الكشف عن وجود عدوى أو فيروس في جسم المريض.
2. كمي. يحدد تركيز الأجسام المضادة لعامل ممرض في جسم الإنسان ، مما يشير إلى مرحلة وشدة تطور المرض.

يوجد أيضًا تصنيف لطرق إجراء ELISA وفقًا لمبدأ إعادة إنتاج التفاعل الضروري.

هناك 3 خيارات:

1. مستقيم. يتم حقن الأجسام المضادة الموصوفة في عينات الدم المقدمة.
2. غير مباشر مع المستضدات.يتم وضع المستضدات الممتزّة بشكل مبدئي في خلايا صفيحة بوليسترين مخصصة لـ ELISA. ثم تضاف إليها الأجسام المضادة للفيروسات ، مما يؤدي إلى تكوين معقدات مناعية ضرورية لمزيد من التقييم للنتائج.
3. غير مباشر مع الأجسام المضادة.غالبًا ما تستخدم هذه الطريقة للأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي. يتضمن الامتصاص الأولي للأجسام المضادة ، وعندها فقط تضاف المستضدات إلى اللوحة.

قواعد أخذ العينات المادية

لتقليل مخاطر الحصول على نتائج خاطئة ، من الضروري التبرع بالدم لتحليلها بشكل صحيح.

قبل الخضوع لـ ELISA ، يجب مراعاة بعض القيود:

• تجنب الإجهاد البدني والعاطفي الشديد ؛
• الإقلاع عن التدخين وشرب الكحول قبل يوم إلى ثلاثة أيام على الأقل ؛
• لبضعة أيام تحتاج إلى التحول إلى التغذية السليمة ؛
• من المستحسن أن تتحكم النساء في مرحلة الدورة الشهرية ، لأن الهرمونات يمكن أن تشوه النتائج ؛
• يجب أن تكون الوجبة الأخيرة قبل 8-10 ساعات من التبرع بالدم ؛
• لمدة 10 أيام ، يتم استبعاد الأدوية التي قد تؤثر على نتائج الدراسة.

بالنسبة إلى ELISA ، يتم أخذ الدم الوريدي من الوريد المرفقي ، ويجب أن يؤخذ في الصباح على معدة فارغة. بشكل عام ، تنطبق القواعد القياسية للتحضير لأخذ عينات الدم الوريدي. اعتمادًا على المرض الذي يتم اختباره ، قد يتم تطبيق متطلبات إضافية. التحضير الأوليمريض.

المنهجية

تعليمات إجراء ELISA بسيطة للغاية:

1. يأخذ المريض الدم من الوريد.
2. يتم تحضير المواد المأخوذة وتقسيمها إلى عينات على لوح شبكي دقيق خاص.
3. يتم خلط المستضدات مع الأجسام المضادة وفقًا للطريقة المختارة.
4. يتم تقييم رد الفعل. تتم مقارنة العينات مع عينات المراقبة ، ويتم إجراء التقييم النوعي والكمي للنتائج.
5. يتم إدخال البيانات في جدول خاص مع تطبيق المؤشرات الكمية (إجمالي الأجسام المضادة).
6. الطبيب المعالج يفك شفرات النتائج. إذا لزم الأمر ، يتم وصف العلاج المناسب.

بعد الفحص ، يتم إعطاء المريض وثيقة بالنتائج. يحتوي على شكل جدول مع التسميات المقابلة لكل نوع من أنواع الغلوبولين المناعي عند التقاطع مع أسماء الأمراض المعدية.

فك التشفير

لن يتمكن سوى المتخصص من فك شفرة نتائج التحليلات بشكل صحيح. من الصعب أن تعرف بنفسك ، على سبيل المثال ، ما تعنيه نتيجة ELISA k = 1 4. يمكن أن يحدث مرض الزهري أيضًا بأشكال مختلفة ، مما يؤثر أيضًا على البيانات النهائية.

تشير النتائج إلى 3 أنواع من الغلوبولين المناعي:

1. IgM. السماح بتحديد فترة الإصابة بمرض الزهري. تشير النتيجة الإيجابية إلى تفاقم المرض. قد يشير غيابهم إلى مغفرة الأمراض المزمنة أو شكل كامن من المرض.
2. إيغا.يشير إلى مرض مضى عليه أكثر من شهر منذ الإصابة. إنها أيضًا علامة على المرحلة الحادة من المرض ، سواء مع الأمراض العادية أو المزمنة المتقدمة.
3. مفتش. إنها علامة على فترة الذروة للمرض ، أي تفاقمه. مع مرض الزهري ، يظهر رد فعل إيجابي بعد العلاج ببعض الوقت. في بعض أنواع الأمراض ، يمكن أن يكون علامة على تطور المناعة.

ينتج الجسم هذه المواد في تسلسل معين ، وهي علامة إضافية على المرض. من خلال الاختبارات النوعية ، يتم إثبات وجود الغلوبولين المناعي فقط في الدم من كل نوع.

يتم التعبير عن هذا في تغيير لون المواد المشاركة في التحليل. المؤشرات الكمية هي مساعدة ، فهي تصف الموقف بشكل أكثر دقة. تشير نسبة المستضدات والأجسام المضادة إلى شدة المرض وشدة استجابة الجسم.

ما يجب القيام به

إذا كان المريض مصابًا بالفعل بمرض الزهري ، يتم دائمًا اكتشاف ELISA الإيجابي ، فمن المستحيل عدم ملاحظة وجود اللولبيات في مثل هذه الدراسة. لا تيأس ، المرض يستجيب بشكل جيد للعلاج ، خاصة في المراحل الأولية.

ماذا تفعل إذا كانت نتيجة الاختبار إيجابية:

• الخضوع لفحوصات إضافية حسب إرشادات الطبيب ؛
• خذ دورة من العلاج بالمضادات الحيوية وفقًا للمخطط المختار ؛
• التركيز على تقوية جهاز المناعة.
• إبلاغ شريكك الجنسي بالمرض ؛
• في المستقبل ، الخضوع للتشخيص الوقائي بانتظام حتى يتم إلغاء التسجيل في المستوصف (بعد 5 سنوات في حالة عدم وجود نتائج اختبار إيجابية).

لا داعي لتأجيل الإجازة المرضية والخوف من إعلان النتائج. يتم تشفير التشخيص ويبقى سريًا ، فقط في حالة وجود تهديد بالعدوى لأشخاص آخرين ، من الضروري إبلاغ الأقارب والشريك الجنسي بالمشكلة حتى يخضعوا للفحوصات المطلوبة.

النتيجة الإيجابية الكاذبة وأسبابها

في بعض الأحيان يتم تسجيل نتيجة الاختبارات الأخرى وتكون ELISA إيجابية كاذبة لمرض الزهري. هذا هو السبب في أنه يوصى بتنفيذ 2-3 طرق المساعدةوبعد فترة كرر المقايسة المناعية للإنزيم.

حالات عدم الدقة هذه نادرة ، فهي ناتجة بشكل أساسي عن هذه العوامل:

• حمل؛
• الأمراض المزمنة؛
• التطعيم الأخير
• إصابة.

تنقسم النتائج الإيجابية الكاذبة إلى حادة ومزمنة ، حسب طبيعة العامل الذي أثارها.

يتم عرض أهمها في الجدول:

بالنسبة لهذه المشاكل الصحية ، قد يظهر اختبار الزهري نتيجة ايجابية، ولكن هذا فقط نتيجة لإنتاج الجسم للبروتينات لمحاربة المرض. ومع ذلك ، فإن ELISA تتعرف عليها كمستضدات.

قد يعاني الطفل السليم حتى سن سنة ونصف من نتائج ELISA الإيجابية الخاطئة إذا أصيبت المرأة بمرض الزهري أثناء الحمل. قبل هذا العمر ، ليس للدم الوقت الكافي لتجديد نفسه تمامًا ، لذلك قد تكون الأجسام المضادة للأم موجودة فيه. الاستثناء هو حالة الكشف عن الغلوبولين المناعي IgM.

يمكنك معرفة المزيد حول ميزات الإنزيم المناعي ومنهجيته من خلال مشاهدة الفيديو في هذه المقالة.