If usuli bilan nima aniqlanadi. Ijobiy Elishay natijasi (enzimatik immunoassay) nimani anglatadi?

UMUMIY FARMAKOPEYA AVTOZLATASI

Birinchi marta taqdim etilgan

Ushbu umumiy farmakopeya monografiyasi ferment immunoassay (ELISA) usulini qamrab oladi. Elishay usuli juda sezgir va o'ta o'ziga xos immunodiagnostik usul bo'lib, uning yordamida antigen, hapten (to'liq bo'lmagan antijen) yoki antikor xususiyatlariga ega bo'lgan turli moddalarni sifat va miqdoriy aniqlash amalga oshiriladi. Elishay usuli odamlar va hayvonlarning yuqumli va yuqumli bo'lmagan kasalliklarini tashxislashda keng qo'llaniladi va immunobiologik tekshiruv sifatini tasdiqlash uchun ham ishlatilishi mumkin. dorilar(ILP).

Usulning printsipi antigenning antikor bilan o'ziga xos o'zaro ta'sirining immun kompleks hosil bo'lishi bilan reaktsiyasi va natijada olingan kompleksni spektrofotometriya, xemiluminesans va boshqa mos usullar yordamida aniqlashdan iborat. Aniqlash to'g'ridan-to'g'ri (sinov moddasining o'zi fermentativ faollikka ega bo'lsa yoki u ferment belgisi bilan belgilangan bo'lsa) va bilvosita yoki bilvosita (qattiq fazada immobilizatsiyalangan antikorlar bilan bog'langan sinov moddasi ferment bilan belgilangan antikorlar bilan inkubatsiya qilinganida) bo'lishi mumkin. ). Sifatli tahlil "ha / yo'q" tamoyiliga ko'ra test materialida antigen yoki antikor tarkibi haqida ma'lumot olish imkonini beradi. Miqdoriy tahlilni o'tkazishda test materialida antigen yoki antikorning kontsentratsiyasi kalibrlash egri chizig'i yordamida aniqlanadi.

UMUMIY HOLAT

Elishay usuli 3 ta asosiy bosqichni o'z ichiga oladi: 1) "antigen (sinov moddasi) - unga xos bo'lgan antikor" immun kompleksining shakllanishi yoki aksincha; 2) oldingi bosqichda hosil bo'lgan immun kompleks bilan yoki erkin bog'lanish joylari (determinantlar) bilan konjugat bog'lanishning shakllanishi; 3) ferment yorlig'i ta'sirida substratning biokimyoviy reaksiya natijasida qayd etilgan signalga aylanishi.

Ferment immunoassayni o'tkazishning barcha usullari bir hil yoki heterojen deb tasniflanadi.

Elishayning barcha 3 bosqichi eritmada o'tadigan va asosiy bosqichlar o'rtasida hosil bo'lgan immun komplekslarni reaksiyaga kirishmagan komponentlardan ajratish uchun qo'shimcha bosqichlar mavjud bo'lmagan texnikalar bir hil Elishay usullari guruhiga kiradi. Odatda past molekulyar og'irlikdagi moddalarni aniqlash uchun ishlatiladigan bir hil Elishayning asosi antijen yoki antikor bilan birlashganda ferment faolligini inhibe qilish jarayonidir. Antigen-antikor reaktsiyasi natijasida fermentning faolligi tiklanadi. Ferment belgisini o'z ichiga olgan antigen-antikor immun kompleksi hosil bo'lganda, ferment faolligi yuqori molekulyar og'irlikdagi substratga nisbatan 95% ga inhibe qilinadi, bu substratning fermentning faol markazidan sterik ravishda ajralib chiqishi bilan bog'liq. Antigen konsentratsiyasi ortishi bilan ko'proq antikorlar bog'lanadi va yuqori molekulyar og'irlikdagi substratni gidrolizlashi mumkin bo'lgan ko'proq erkin antigen-ferment konjugatlari saqlanib qoladi. Bir hil Elishay usuli juda tezdir. Bitta ta'rifni tahlil qilish uchun 1 daqiqa vaqt ketadi. Usulning sezgirligi ancha yuqori. Uning yordamida siz pikomollar darajasidagi moddani aniqlashingiz mumkin.

Heterojen usullar uchun ikki fazali tizimda qattiq faza ishtirokida tahlil qilish odatiy holdir - tashuvchi va immun komplekslarini turli fazalarda bo'lgan reaksiyaga kirmagan komponentlardan (yuvish) ajratish bosqichi (hosil bo'lgan immunitet). komplekslar qattiq fazada, reaksiyaga kirmagan komplekslar esa eritmada) majburiydir. Birinchi bosqichda immun komplekslarning shakllanishi qattiq fazada davom etadigan geterogen usullar qattiq fazali usullar deb ataladi.

Usullar bir jinsli-geterojen deb tasniflanadi, agar birinchi bosqich - o'ziga xos komplekslarning hosil bo'lishi - eritmada sodir bo'lsa, so'ngra komponentlarni ajratish uchun immobilizatsiyalangan reaktivli qattiq faza ishlatilsa.

Heterojen Elishay usuli 3 asosiy bosqichdan iborat:

• qattiq fazada antigen yoki antikorning immobilizatsiyasi, hosil bo'lgan kompleks immunosorbent deb ataladi;
• bog'lanmagan reagentni olib tashlash va qattiq tayanchdagi bog'lanish joylarini, masalan, albumin, kazein kabi blokirovka qiluvchi oqsillar bilan blokirovka qilish; tahlil qilinayotgan preparatni bog'lanishi uchun immunosorbent bilan inkubatsiya qilish;

3) tekshirilayotgan moddaning o'zining fermentativ faolligi yoki tahlil qilinayotgan preparat bilan bog'liq bo'lgan fermentativ yorliq tufayli aniqlash (to'g'ridan-to'g'ri variant). Ba'zi hollarda "immunosorbent-sinov moddasi" kompleksining enzimatik yorliq bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar bilan qo'shimcha inkubatsiyasi amalga oshiriladi (bilvosita variant).

Tahlil qiluvchi moddani miqdoriy aniqlash ishlatiladigan detektorga mos keladigan substratni qo'shish va tahlil qiluvchining signalini standart namuna bilan solishtirish orqali amalga oshiriladi.

Heterojen Elishay usuli raqobatdosh bo'lmagan Elishay va raqobatbardosh Elishayga bo'linadi. Tahlil sxemalari zarur talablarga muvofiq dorivor mahsulotni ishlab chiqish jarayonida o'zgartirilishi mumkin. O'zgartirishlar monografiyada yoki normativ hujjatlarda ko'rsatilishi kerak. Elishay usulini tanlash sinov moddasining tabiatiga va uning miqdoriga bog'liq, chunki turli xil turlari ELISA turli xil sezgirlikka ega. Antikorlarni o'z ichiga olgan moddalarning sifatini baholash uchun o'ziga xos anti-idyotipik antikorlardan foydalanish mumkin.

Raqobatdosh bo'lmagan Elishay usuli

Raqobatdosh bo'lmagan Elishay usuli aniqlash turiga (to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh, bilvosita (bilvosita) raqobatbardosh) va qattiq fazada (antigen yoki antikor) immobilizatsiyalangan moddaning turiga ko'ra bir necha turlarga bo'linadi.

To'g'ridan-to'g'ri ELISA

2 usulda amalga oshirilishi mumkin. Birinchi holda, tekshirilayotgan modda (antigen) qattiq fazada bevosita immobilizatsiya qilinadi; keyin antigenga bog'langan etiketli antikor detektor hisoblanadi. Sinovni boshqa usulda o'tkazishda qattiq fazada immobilizatsiyalangan antikorlar qo'llaniladi. Bunday holda, detektor ferment bilan belgilangan sinov moddasidir.

Bilvosita (bilvosita) Elishay varianti

Elishayning bilvosita variantini bajarishda antigen qattiq fazada immobilizatsiya qilinadi. Bloklashdan so'ng antigenga unga xos bo'lgan antikorlarning eritmasi qo'shiladi. Inkubatsiyadan so'ng hosil bo'lgan antigen-antikor kompleksi bog'lanmagan antikorlardan yuviladi va detektor vazifasini bajaradigan ferment bilan belgilangan anti-immunoglobulin (anti-Ig) qo'shiladi. Anti-Ig detektorlari ma'lum Ig sinflari va pastki sinflari uchun sotuvda mavjud bo'lib, bu tahlil formatini antikor izotiplash uchun qulay qiladi. Bundan tashqari, etiketli anti-Ig dan foydalanish to'g'ridan-to'g'ri Elishay bilan solishtirganda signalni kuchaytiradi va shu bilan tahlilning sezgirligini oshiradi.

Elishay varianti sifatida sendvich usuli

Eng keng tarqalgan raqobatdosh bo'lmagan usul - bu "sendvich" usuli. Qattiq fazada amalga oshirilganda, birlamchi antikorlar ularning keyingi bloklanishi bilan immobilizatsiya qilinadi. Keyin, antijeni o'z ichiga olgan sinov moddasi ularga qo'shiladi va inkubatsiya qilinadi. Inkubatsiyadan so'ng antigen-antikor kompleksi bog'lanmagan antigendan yuviladi, ferment bilan belgilangan ikkilamchi antikorlar qo'shiladi va aniqlash amalga oshiriladi.

Raqobatbardosh Elishay usuli

Raqobatbardosh Elishay usuli bir necha turlarga bo'linadi: aniqlash turiga ko'ra (to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh, bilvosita (bilvosita) raqobatbardosh) va qattiq fazada immobilizatsiya qilingan moddaning turiga ko'ra (antigen yoki antikor).

To'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh Elishay

Eriydigan antijenlarni aniqlash yoki miqdorini aniqlash uchun qattiq fazada immobilizatsiyalangan antigen bilan to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh Elishay qo'llaniladi. Buning uchun tegishli detektor bilan konjugatsiyalangan antigenga xos antikorlardan foydalaning (masalan, horseradish peroksidaza, ishqoriy fosfataza, ruteniy yoki floresein). Standart antijen qattiq fazaga immobilizatsiya qilinadi, so'ngra bloklanadi. Ferment bilan belgilangan antikor sinov moddasi (eruvchan antijen) bilan inkubatsiya qilinadi. Keyin bu aralashma immobilizatsiyalangan antigenga qo'shiladi, inkubatsiya qilinadi va keyin bog'lanmagan antigen-antikor kompleksidan yuviladi. Keyingi qadam, belgilangan ferment uchun tegishli substratni qo'shishdir. Raqobatbardosh eruvchan antijeni bo'lmagan nazorat namunasi bilan solishtirganda tizimda 2 ta antijen mavjudligi sababli reaktsiyaning inhibisyonu tekshirilayotgan moddaning miqdori qiymatiga teskari proportsionaldir.

Qattiq fazada immobilizatsiyalangan antikor bilan to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh Elishayni bajarish qattiq fazada immobilizatsiyalangan antigen bilan to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh Elishayga o'xshaydi, lekin antikorlarni aniqlash yoki miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi.

Bilvosita (bilvosita) raqobatbardosh Elishay

Ushbu Elishay usuli to'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh variantga o'xshaydi, ammo aniqlash uchun etiketli antikor yoki antijen o'rniga mos ravishda etiketli anti-Ig reagenti yoki etiketli ikkilamchi antikorlar qo'llaniladi.

Usul uchun umumiy shartlarELISA

Ferment immunoassay uchun qattiq faza sifatida turli materiallar qo'llaniladi: silikon, nitroselüloz, poliamidlar, polistirol, polivinilxlorid, polipropilen, akril va boshqalar. Qattiq faza probirkaning devorlari, 96-quduqli va boshqa plitalar, sharlar, boncuklar, shuningdek, nitroselüloza va oqsillarni faol ravishda o'zlashtiradigan boshqa membranalar bo'lishi mumkin. Immobilizatsiya printsipi (gidrofobik, hidrofil, kovalent o'zaro ta'sir) qattiq fazani tanlashga bog'liq. Eng ko'p ishlatiladigan qattiq faza 96 quduqli plastik mikrotitr plitalari. Plitadagi quduqlar soni har xil bo'lishi mumkin. Plastinka shaffof (kolorimetrik aniqlash) va noaniq (xemilyuminessent aniqlash, florimetriya) bo'lishi mumkin.

Immobilizatsiya quduqda havo pufakchalarisiz amalga oshirilishi kerak, chunki ularning mavjudligi optik zichlik ko'rsatkichini o'zgartiradi. Biotinlangan immobilizatsiyalangan reagentlardan foydalanish mumkin. Bunday holda, reaktsiyada streptavidin va biotinlangan ferment belgisi qo'llaniladi. Bu usul signalni kuchaytirish uchun ishlatiladi. Reaktivning kinetik tabiati, barqarorligi va konsentratsiyasiga qarab immobilizatsiya vaqti va harorati monografiya va me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilishi kerak.

Ferment immunoassayning barcha bosqichlari, yuvish va blokirovkalash eritmalari, har bir bosqich uchun vaqt oralig'i va harorat sharoitlari, shakerda inkubatsiya uchun daqiqada aylanishlar soni, aniqlash shartlari monografiya va me'yoriy hujjatlarda ham ko'rsatilishi kerak.

Elishayning ayrim turlari uchun usullarga misollar

Bilvosita raqobatdosh bo'lmagan Elishay usuli

1. Antigenning sorbsiyasi. 0,1-0,5 mkg antigen va 100 mkl 0,05 M karbonat-bikarbonat bufer eritmasi (pH 9,6), agar monografiyada yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 96 quduqli plastinkaning har bir qudug'iga qo'shiladi va keyin haroratda sorbsiya qilinadi. 16 soat davomida 4 ° C. Yuqori pH qiymatiga ega bo'lgan boshqa bufer eritmalaridan foydalanish mumkin. Inkubatsiya gorizontal plastinka silkitgichda silkitish orqali amalga oshiriladi.

Bog'lanmagan antigen molekulalarini yuvish (ikki marta), agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 0,1% tween-20 (har bir quduq uchun 300 µl) bo'lgan fosfat-buferli tuz eritmasi (pH 9,0) bilan amalga oshiriladi.

1. Bloklash. Antigenlar yoki antikorlarning o'ziga xos bo'lmagan bog'lanish joylarini blokirovka qilish uchun plastinkaning quduqlari fosfat-buferli tuz eritmasi (pH 9,0) yoki farmakopeya monografiyasida yoki 1% eritmani o'z ichiga olgan me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilgan boshqa bufer eritmasi bilan to'ldiriladi. sigir zardobidagi albumin yoki boshqa oqsillar (kazein, jelatin, sut kukuni va boshqalar) va xona haroratida 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi (agar monografiya yoki normativ hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa).

III. Maxsus antikorlarni titrlash. Agar miqdorni aniqlash zarur bo'lsa, sinov moddasi (antigen yoki antikor) standart namunaga (RS) parallel ravishda ketma-ket suyultirishda titrlanadi.

Titrlash plitaning gorizontal va vertikal qatorlarida ham amalga oshirilishi mumkin. Shuni ta'kidlash kerakki, antikor titrlash antikorlarning optimal konsentratsiyasini tanlash yoki ularning titrini aniqlash zarur bo'lganda amalga oshiriladi. Antikorlarning optimal kontsentratsiyasi va / yoki titri aniqlangan taqdirda, ushbu antikorlar (zardob) uchun tavsiya etilgan suyultirish qo'llaniladi.

Titrlashda antikorlarning tayyor suyultirilishi qatorning birinchi qudug'iga kiritiladi - har bir quduqqa o'rtacha 1-10 mkg, keyin quduqlarda antikorlarning ketma-ket suyultirilishi amalga oshiriladi. O'ziga xos antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida gorizontal plastinka silkitgichda chayqalgan holda amalga oshiriladi.

Yuvish 0,1% tween-20 ni o'z ichiga olgan pH 9,0 fosfat-buferli tuz eritmasi yordamida kamida 3-4 marta amalga oshiriladi.

1. Enzim yorlig'i bilan konjugatsiyalangan antiturlar (antiglobulin) antikorlarini qo'shish. Detektor (ikkilamchi) antikorlar sifatida fermentativ yorliq bilan konjugatsiyalangan turlarga qarshi poliklonal antikorlar qo'llaniladi. Ko'pincha echki yoki quyon antikorlari ishlatiladi, ular butun molekula yoki o'ziga xos antikorlarning Fc bo'laklari uchun xosdir. Detektor antikorlarining kontsentratsiyasi odatda ishlab chiqaruvchi tomonidan stok eritmasining suyultirilishi sifatida ko'rsatiladi (masalan, 1:1000).

Ikkilamchi yorliqli antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida gorizontal plastinka silkitgichda chayqatiladi.

Yuvish kamida 3-4 marta 0,1% tween-20 ni o'z ichiga olgan fosfat-buferli tuz eritmasi (pH 9,0) yordamida amalga oshiriladi.

Inkubatsiya 10 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka shakerida chayqatiladi.

1. Quduqlarga 100 mkl substrat eritmasi qo'shiladi va doimiy aralashtirish bilan xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi. Enzimatik reaktsiyani to'xtatish uchun barcha sinov va nazorat namunalariga teng miqdorda qo'shiladigan "to'xtatuvchi reagent" ishlatiladi. Ko'pincha sulfat kislota "to'xtash reagenti" sifatida ishlatiladi.

To'g'ridan-to'g'ri raqobatdosh bo'lmagan ELISA usuli

To'g'ridan-to'g'ri Elishay usuli bilvosita raqobatdosh bo'lmagan Elishay usulidan faqat kichik farqlarga ega. Shunday qilib, tahlilning har ikkala turida I va II bosqichlar bir xil. Farq shundaki, III bosqichda Elishayning to'g'ridan-to'g'ri versiyasida test antijeni uchun xos bo'lgan antikorlar ferment yorlig'i bilan konjugatsiya qilinadi va ular to'g'ridan-to'g'ri sinov moddasi bilan o'zaro ta'sir qiladi. Agar kerak bo'lsa, konjugatlarni avval konjugatsiyalanmagan antikorlar uchun tavsiflangan tarzda titrlash ham mumkin. To'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh bo'lmagan Elishay doirasida IV bosqich o'tkazilmaydi.

"Sendvich" usuli ELISA

Elishayning ushbu variantida o'rganilayotgan antigenning fazoviy uzoq epitoplariga xos bo'lgan bir juft antikor (birlamchi va ikkilamchi) qo'llaniladi.

1. Qattiq fazada antikorlarning sorbsiyasi. Antigenni sorbsiyalash usuli "Bilvosita raqobatdosh bo'lmagan Elishay" bo'limidagi antitellarni sorbsiyalash usuliga o'xshaydi.
2. Bloklash. Substratdagi (qattiq faza) o'ziga xos bo'lmagan bog'lanish joylarini blokirovka qilish texnikasi "Bilvosita raqobatdosh bo'lmagan Elishay" bo'limida tavsiflangan blokirovkalash texnikasiga o'xshaydi.

III. Antigen bilan inkubatsiya. Agar monografiyada yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 50 mkl sinov moddasi va antigenning standart suyultirishlari oldindan so'rilgan antikorlar bilan planshetning quduqlariga qo'shiladi. Antigen suyultirishlari 0,1% Tween-20 ni o'z ichiga olgan fosfat tamponlangan sho'r (pH 9,0) bilan tayyorlanishi kerak, chunki Tween-20 oqsil molekulalarining bir-biriga va plastinka yuzasiga o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishini kamaytiradi. Sinov moddasi ham, standart antigen suyultirgichlari ham har bir oqsil suyultirilishi uchun 2 (3) quduqdan foydalanib, gorizontal qatordagi (yoki 3 ta takroriy) qo‘shni quduqlarga juft bo‘lib qo‘shiladi.

Inkubatsiya xona haroratida 30 daqiqa davomida doimiy aralashtirish bilan amalga oshiriladi. Yuvish kamida 3-4 marta 0,1% tween-20 ni o'z ichiga olgan fosfat tamponli tuz eritmasi (pH 9,0) yoki monografiya yoki me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilgan boshqa bufer eritmasi bilan amalga oshiriladi.

1. Ferment bilan belgilangan antikorlar bilan inkubatsiya. Tabletka quduqlariga ferment yorlig'i bilan konjugatsiyalangan o'ziga xos antikorlarning 100 mkl eritmasi qo'shiladi. Konjugatsiyalangan antikorlarning optimal kontsentratsiyasi, qoida tariqasida, monografiya yoki me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilgan (odatda 2-4 mkg / ml konsentratsiyadan foydalaniladi).

Ferment bilan belgilangan antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida gorizontal plastinka silkitgichda chayqalgan holda amalga oshiriladi.

Yuvish kamida 3-4 marta 0,1% tween-20 yoki monografiya yoki me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilgan boshqa bufer eritmasini o'z ichiga olgan fosfat tamponli tuz eritmasi (pH 9,0) yordamida amalga oshiriladi.

1. Rangli mahsulot paydo bo'lishi bilan birga fermentativ reaktsiyani o'tkazish. Enzimatik reaktsiyani o'tkazish tartibi bo'limda tavsiflangan protseduraga o'xshaydi: "Bilvosita raqobatdosh bo'lmagan Elishay usuli".

aniqlash

Yuqorida aytib o'tilganidek, aniqlash uchun ferment belgisi yoki boshqa reagent bilan etiketlangan antikorlar qo'llaniladi. Ferment yorlig'i, masalan, horseradish peroksidaza, gidroksidi fosfataza yoki galaktosidaza bo'lishi mumkin. Antikorlar yoki boshqa belgilarga ega antijenler detektor sifatida ishlatilishi mumkin. Aniqlash reaktivini tanlash antikor yoki antijen bilan konjugatsiyalangan yorliq turiga va aniqlash usuliga bog'liq.

Aniqlash usullari sifatida yorliqni tanlash asosida spektrofotometriya, xemiluminesans, florimetriya va boshqa usullardan foydalanish mumkin.

Kantitativ Elishay usulining natijalari

Kantitativ Elishay usulining natijalari teskari regressiya bilan chiziqli kalibrlash egri chizig'idan yoki teskari regressiya bilan chiziqli bo'lmagan kalibrlash egri chizig'idan foydalangan holda murakkab usul yordamida hisoblanadi. Natijalarni sharhlash usuli Elishayni o'rnatish uchun ishlatiladigan usulga bog'liq. Masalan, kalibrlash egri chizig'i yordamida sinov natijalaridan siz noma'lum namunaning kontsentratsiyasini baholashingiz, inhibisyonning yarim maksimal kontsentratsiyasini yoki samarali kontsentratsiyani baholashingiz mumkin. Bu sizga tekshirilayotgan moddaning miqdorini yoki uning faolligini mos yozuvlar/kalibrlash standarti (RS) bilan solishtirganda aniqlash imkonini beradi. Odatda, tahlil qilinadigan preparatning kontsentratsiyasini tavsiflovchi miqdoriy Elishay usulini bajarishda kalibrlash egri chizig'ining shakli chiziqli bo'lmagan holda hisoblangan o'rtacha qiymatga bog'liq. Shu munosabat bilan olingan egri chiziqni tahlil qilish uchun turli matematik modellardan foydalanish tavsiya etiladi. Boshqa hollarda, Elishay usuli usulning sezgirligi doirasida namunadagi ma'lum bir sinov moddasi mavjudligini baholash uchun sifatli usul sifatida qo'llaniladi.

Eslatma.

Karbonat-bikarbonat bufer eritmasini tayyorlash (pH 9,6). 1,59 g natriy karbonat (suvsiz) yoki 4,29 g natriy karbonat 10-suvli va 2,93 g natriy gidrokarbonat 1000 ml sig'imli o'lchov tsilindriga qo'shiladi, 800 ml tozalangan suvda eritiladi, pH 9.6 ga sozlanadi. , aralashtiriladi, keyin eritmaning hajmini tozalangan suv bilan belgiga keltiring va yana aralashtiring.

(ELISA) - bu maxsus hujayralarni - antikorlarni qidirishga asoslangan laboratoriyada qonni tekshirish usuli. turli kasalliklar. Usul nafaqat patogenni aniqlashga, balki patologik jarayonning qaysi bosqichida ekanligini aniqlashga imkon beradi. Ikkinchisi bemorning prognozi va keyingi davolanishi uchun juda muhimdir.

Usulning afzalliklari va kamchiliklari

Hammasi orasida zamonaviy usullar diagnostik Elishay eng innovatsion va texnik jihatdan aniq. Uning asosiy afzalliklari quyidagilardan iborat:

1. Bemorning qonida yuqumli kasalliklarga qarshi barcha mavjud antikorlarni izlash qobiliyati.
2. Tadqiqot usulining yuqori mavjudligi. Bugungi kunda Elishay tahlillari har qanday o'rta laboratoriya tomonidan amalga oshirilishi mumkin.
3. Usulning deyarli 100% o'ziga xosligi va sezgirligi.
4. Antikorlar va antijenlarni izlash qobiliyati, shuningdek, bosqichni o'rnatish patologik jarayon va miqdorini taqqoslash tufayli uning dinamikasini kuzatish.

Boshqa testlarga nisbatan bunday bir qator afzalliklar tahlilning yagona va yagona kamchiliklarini to'liq qoplaydi: u antikorlarni aniqlashga qodir, ammo patogenning o'zi emas.

Tahlilni baholash uchun asosiy atamalar

Elishay tahlili nima ekanligini, nima ekanligini va qanday amalga oshirilishini tushunish uchun siz mutaxassislar tomonidan qo'llaniladigan asosiy atamalar bilan tanishishingiz kerak.

1. Antikor- inson immunitet tizimining hujayralari tomonidan ishlab chiqariladigan protein (B tipidagi limfotsitlar). Ular begona agent yoki moddaning yutilishiga o'ziga xos reaktsiya bilan javob berishadi. Antikorlarning yana bir nomi - immunoglobulinlar, ular turli sinflarga tegishli: A, E, M, G. Ular bir-biridan massasi, javob tezligi, yarim yemirilish davri va boshqa bir qator xususiyatlar bilan farqlanadi. Odatda odam qonida asosan G toifali immunoglobulinlar mavjud.Har qanday infektsiya sodir bo'lsa, A va M immunoglobulinlarining miqdori keskin ortadi.Allergik reaktsiyalarda E immunoglobulinlari ishtirok etadi.
2. Antigen- organik kelib chiqishi va yuqori molekulyar og'irlikdagi xorijiy agent. Ko'pincha bu patogenlar yoki ularning biologik faol moddalari.
3. Antigen-antikor kompleksi yoki immun kompleksi to'g'ridan-to'g'ri begona moddalar va immunoglobulinning birikmasidan iborat bo'lib, bu immunitet reaktsiyasini keltirib chiqaradi.

Usulning mohiyati va ko'lami

Bemorlarda ko'pincha savol tug'iladi: Elishay tahlili, bu nima, u qanday amalga oshiriladi va u nima uchun? Usul haqida uning bosqichlarini qisqacha tavsiflab, qulay tarzda gapirishingiz mumkin.

Tayyorgarlik bosqichi. Laboratoriya shifokori 96 quduqli maxsus plastinkadan foydalanadi. Har bir quduq yuzasiga ma'lum bir patogenning antijeni qo'llaniladi.

1-bosqich Qon olinadi, keyin u quduqqa tomchilab yuboriladi. Quduq qondagi antijen va antikor o'rtasidagi reaktsiyani boshlaydi.

2-bosqich Quduqda immun komplekslarning shakllanishi bilan reaktsiya to'liq davom etadi. Natijada, ma'lum bir rangdagi modda hosil bo'ladi. Rangning intensivligi bemorning qonidagi har bir o'ziga xos patogenga antikorlar miqdoriga bog'liq.

3-bosqich Natijani fotometriya orqali baholash. Buning uchun spektrofotometr deb ataladigan maxsus qurilma ishlatiladi. U quduqdagi materialning zichligini va nazorat namunasini taqqoslaydi. Bundan tashqari, qurilma matematik tahlil orqali natijani yaratadi.

Elishay natijalari va maqsadini baholash

Natijani talqin qilish bir nechta muhim nuanslarga bog'liq:

1. Quduqning optik zichligi.
2. Quduq plastinka ishlab chiqaruvchisi (sinov tizimlari).
3. Tadqiqot o'tkazilgan laboratoriya.

Ushbu nuanslarni hisobga olgan holda, siz hech qachon turli sinov tizimlari yoki turli laboratoriyalardan olingan ikkita natijani solishtirmasligingiz kerak.

Elishay tahliliga ta'sir qiladigan yana bir muhim nuqta - bu antikorlarning avidligi. Ushbu parametr antigen miqdorini, antigen-antikor kompleksidagi bog'lanishning mustahkamligini tavsiflaydi. Uning ta'rifi protein tuzilmalarini hal qilish uchun immun kompleksini karbamid bilan davolashga asoslangan. Bu sizga antigen va antikor o'rtasidagi zaif aloqalarni yo'q qilish va faqat kuchlilarini qoldirish imkonini beradi. Avidite uchun tadqiqotning ahamiyati shundaki, u infektsiyaning davomiyligini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu ma'lumot homilador ayollarga tashxis qo'yish uchun juda muhimdir.

ELISA qon testi quyidagilarga xizmat qiladi:

1. Patogenlarning turli antijenlarini qidirish.
2. Gormonal fonni o'rganish.
3. Otoimmün kasallikning mavjudligini tekshirish.
4. Belgilarni aniqlash uchun onkologik kasalliklar.

Elishay navlari

Elishay tahlilining quyidagi turlari mavjud:

1. Bilvosita.
2. Streyt.
3. Raqobatbardosh.
4. blokirovka qilish usuli.

Ammo, aslida, bugungi kunda faqat ELISA (ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili) deb ataladigan usul qo'llaniladi. U quduq yuzasida rang o'zgarishi bilan antigen-antikor kompleksi hosil bo'lishining yuqorida tavsiflangan reaktsiyasiga asoslanadi.

To'g'ridan-to'g'ri miqdoriy Elishay qon testi alohida e'tiborga loyiqdir. Bu tahlil turi emas, balki natijalarni baholash usuli. Unga rahmat, antikorlar soni hisoblanadi va ularning sinflari aniqlanadi. Natija namunaning optik zichligiga, Elishay tekshiruvi o'tkazilgan sinov tizimiga, shuningdek, laboratoriyaga bog'liq.

Elishay tomonidan aniqlangan kasalliklar

ELISA - bu juda ko'p turli xil yuqumli kasalliklarni aniqlashga imkon beruvchi qon testi. Bundan tashqari, virusli va bakterial kasalliklar bir xil aniqlik bilan aniqlanadi. Masalan, immun komplekslarni shakllantirish yordamida quyidagi kasalliklarning qo'zg'atuvchisi antijenlari mavjudligini isbotlash mumkin:

Bundan tashqari, ELISA sizga quyidagilarni aniqlashga imkon beradi:

1. Saraton markerlari - TNF (o'simta nekrozi omili), PSA (prostata o'ziga xos antijeni), CEA (saraton-embrion antijeni), CA-125 (tuxumdon o'simtasi markeri)
2. Homiladorlik gormoni hCG (inson xorionik gonadotropini).
3. Qoidabuzarliklar reproduktiv tizim: ayol va erkak jinsiy tizimining gormonlari.
4. Qalqonsimon bezning patologiyasi.

Shuni ta'kidlash kerakki, bugungi kunda OIV uchun Elishay testi ushbu xavfli kasallikni tashxislashning asosiy usuli hisoblanadi.

Elishay materiallari va namuna olish texnikasi

Elishayni o'tkazish uchun bemorning qoni och qoringa olinadi. Bundan tashqari, qondan sarum olinadi, u to'g'ridan-to'g'ri tahlil qilish uchun ishlatiladi. Bundan tashqari, ELISA miya omurilik suyuqligi (CSF), bachadon bo'yni kanalining shilliq qavati (serviks), amniotik suyuqlik va hatto suyuqlikda ham amalga oshirilishi mumkin. shishasimon tanasi(ko'z olmasi).

Qon topshirishdan oldin bemorga hech qanday dori-darmonlarni qabul qilmaslik va antibiotiklar bilan davolash va davolash kerakligi haqida ogohlantiriladi antiviral preparatlar qon namunalarini olishdan kamida ikki hafta oldin tugatish tavsiya etiladi.

Natijalarni qabul qilish va talqin qilish shartlari

Laboratoriyadan javob olish vaqti uning ish tezligiga bog'liq emas, balki kasallikning bosqichiga va qonda qanday antikorlar allaqachon paydo bo'lganiga bog'liq. Masalan, immunoglobulinlar M tahlil qilish uchun qon qabul qilinganidan keyin taxminan 2 hafta o'tgach paydo bo'ladi va bu jarayon birlamchi infektsiya bosqichida yoki surunkali kasallikning kuchayishi sodir bo'lganligini anglatadi. Shu bilan birga, birlamchi infektsiya paytida M va G sinflarining antikorlari paydo bo'ladi. Bundan tashqari, ikkinchisi 4 haftadan keyin aniqlanishi mumkin.

IgA 2-3 haftadan so'ng yakka o'zi yoki M bilan birga paydo bo'ladi, bu o'tkir infektsiyani ko'rsatadi yoki G bilan birga surunkali jarayonni ko'rsatadi.

Bunday turli sanalar qondagi antikorlarning paydo bo'lishi bemorni natija uchun uzoq vaqt kutishga majbur qiladi. Elishay tahlili o'tkazilgandan keyin bir oydan ko'proq vaqt kutish mumkin. Shifokor tomonidan dekodlash va talqin qilish ham ma'lum vaqtni oladi.

Taraqqiyot bilan zamonaviy tibbiyot bemorda ma'lum patologiyalarga shubha bo'lsa, chuqurroq diagnostika o'tkazish mumkin. Ma'lumot beruvchi usullardan biri laboratoriya tadqiqotlari venoz qonni olish usuli bilan amalga oshiriladigan Elishay tahlili edi. Ya'ni, umuman bemor uchun hech narsa o'zgarmaydi. Ammo Elishay laboratoriya yordamchisi to'plangan biomaterialni o'rganish uchun murakkab texnikani o'tkazadi. Elishay tahlillari nima va diagnostika sifatida Elishay usulidan foydalanishning nozik tomonlari qanday, biz quyidagi materialni tushunamiz.

Ferment immunoassay nima?

Antikorlarning ishlab chiqarilishi inson tanasiga kirgan antijenlarning o'zlari tomonidan qo'zg'atiladi. Tananing sog'lig'i uchun "jangga" kirishda, antikorlar, go'yo o'zlarini antijenler bilan belgilaydilar, buni laboratoriya yordamchisi qon testida ko'radi. Ya'ni, to'plangan biomaterialda nafaqat infektsiyaning mavjudligini, balki tananing to'liq tiklanganidan keyin uning izlarini ham kuzatish mumkin.

Shunday qilib, tayinlash bog'langan immunosorbent tahlili bemorga qon, davolovchi shifokor infektsiyaning davomiyligini, uning rivojlanish darajasini kuzatishi yoki ma'lum bir infektsiyaga qarshi immunitet mavjudligini aniqlashi mumkin.

Elishay diagnostikasi jarayoni quyidagicha ko'rinadi:

• Olingan venoz qon laboratoriyada qon zardobi holatiga keltiriladi;
• Keyin laboratoriya yordamchisi hujayralar bilan maxsus patnisdan foydalanadi, ularning har biri allaqachon barcha kerakli antijenlarni o'z ichiga oladi. Har bir hujayraga qon zardobini tushirish va immunoglobulinlarning (antikorlarning) antijenlarga reaktsiyasini kuzatish kifoya. "Istalgan" reaktsiyaning mavjudligi o'rganilayotgan materialning rangi o'zgarishi bilan ko'rsatiladi. Kelajakda laborant o'rganilayotgan muhitning optik zichligini o'rganadi.

• Askarioz va enterobioz (yumaloq qurtlar va pinworms);
• trixinoz;
• O'tkir va surunkali shakllarda opistorxoz;
• Giardiaz;
• Amoebioz;
• Toksoplazmoz;
• Har qanday shaklda leyshmanioz.

Muhim: ferment immunoassay ham sifat, ham miqdoriy bo'lishi mumkin. Birinchi holda, laboratoriya yordamchisi faqat qonda kerakli moddaning mavjudligini tasdiqlaydi yoki rad etadi. Ikkinchi holda, tahlil natijasida bemorning tanasida uning kontsentratsiyasi ko'rsatiladi.

Usulning kamchiliklari

Ushbu diagnostika usulining barcha afzalliklari bilan shuni tushunish kerakki, ferment immunoassay bemorning kasalligining sababini topish usuli emas, balki faqat davolovchi shifokor tomonidan da'vo qilingan tashxisni tasdiqlash usulidir. Va tadqiqot juda qimmat ekanligini hisobga olib, undan oqilona foydalanish kerak. Bunday holda, tadqiqot natijalari faqat malakali mutaxassis tomonidan talqin qilinishi kerak.

Natijalarni dekodlash

IFA qisqartmasi va bu nima ekanligini demontaj qilganimizdan so'ng ─ aniqlangan bo'lsa, natijalarni sharhlashga o'tishga arziydi. Bu erda tushunish kerakki, agar tahlil sifatli amalga oshirilgan bo'lsa, unda natija faqat ijobiy yoki salbiy bo'ladi. Ya'ni, tashxis shifokorning ma'lum bir tashxisga nisbatan shubhalarini tasdiqlaydi yoki ularni rad etadi. Bunday holda, shakl mos ravishda "+" yoki "-" belgilarini o'z ichiga oladi.

Muhim: testning salbiy natijasi har doim ham infektsiyaning yo'qligini ko'rsatmaydi. Gap shundaki, antijenlarga qarshi antikorlar infektsiyadan keyin 14 kun ichida paydo bo'lishi mumkin va ular hali shakllanmagan bo'lishi mumkin.

Agar miqdoriy tahlil o'tkazilsa, bu erda antikorlarning turi, ularning soni va faoliyat bosqichi aniqlanadi. Xususan, bunday tashxis bilan infektsiyaning rivojlanishining turli davrlarida hosil bo'lgan antikorlar (immunoglobulinlar) IgG va IgM aniqlanadi. Bu holatda eng keng tarqalgan natijalar:

• IgMning ko'tarilishi va IgG ning to'liq yo'qligi. Ushbu rasm yaqinda infektsiyani va patologiyaning o'tkir bosqichini ko'rsatadi.
• Ikkala turdagi immunoglobulinlarning (IgM va IgG) faolligi oshishi. U yuqumli jarayonning uzoq muddatli va surunkali kursi haqida gapiradi.
• IgG faolligi va IgM ning to'liq yo'qligi. Infektsiya kamida olti oy oldin bo'lgan va hozirda virus uzoq davom etgan surunkali bosqichda.
• IgG va IgA antikorlarining yo'qligi. Natija aniqlanmagan.
• IgM, IgA va IgG antikorlarining yo'qligi. Muayyan infektsiyaga qarshi immunitetning etishmasligini ko'rsatadi.
• IgG, IgM va IgA antikorlarining faolligi surunkali jarayonning kuchayishini ko'rsatadi.

Antikorlarning turlarini aniqlashdan tashqari, formaning maxsus ustunida laboratoriya yordamchisi ham qon hajmiga ularning sonini ko'rsatadi. Esingizda bo'lsin, Elishay usuli nima ekanligini tushunib, natijalarni o'zingiz talqin qilmang. Olingan natijalar faqat davolovchi shifokor tomonidan tavsiya etilgan tashxisga qarab, aniqlik bilan talqin qilinishi mumkin. klinik rasm bemorda.

Ko'pincha amalda qattiq fazali immunoassayning uchta varianti qo'llaniladi - bilvosita immunoassay, to'g'ridan-to'g'ri immunoassay va sendvich tipidagi immunoassay. Ushbu turdagi immunoassaylar o'rtasidagi farqlar quyidagicha. Immunoassayning bilvosita versiyasida antigen birinchi bosqichda polistirol plitasining quduqlari yuzasida so'riladi. Bog'lanmagan antigen molekulalarini olib tashlangandan so'ng, ushbu antigenga xos antikorlarni o'z ichiga olgan namuna qo'shiladi. Olingan antigen-antikor komplekslari yorliq bilan konjugatsiyalangan anti-tur antikorlari yordamida aniqlanadi (1A-rasm). Immunoassayning to'g'ridan-to'g'ri versiyasida adsorbsiyalangan antigenni aniqlash to'g'ridan-to'g'ri yorliq bilan konjugatsiyalangan maxsus antikorlar yordamida amalga oshiriladi (1B-rasm). Sendvich tipidagi immunoassayda, birinchi bosqichda plastinka yuzasida antigen emas, balki o'rganilayotgan antigenga xos bo'lgan antikorlar (substrat antikorlari) adsorbsiyalanadi. Bog'lanmagan antikor molekulalarini olib tashlaganingizdan so'ng, antijeni o'z ichiga olgan namuna qo'shiladi. Hosil bo'lgan substrat-antigen antikor kompleksini aniqlash uchun boshqa, fazoda uzoq antigen epitopiga xos bo'lgan, qandaydir yorliq bilan konjugatsiyalangan ikkinchi antikorlar qo'shiladi (1B-rasm). Immunoassayda antigenning ikki xil epitopiga xos sendvich tipidagi antikorlardan foydalanish hatto qon plazmasi kabi heterojen namunalarda ham antigenni aniqlashda yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslikka erishish imkonini beradi.

Guruch. 1. Bilvosita (A), to'g'ridan-to'g'ri (B) va sendvich tipidagi immunoassay (C) printsipi

Bilvosita ferment immunoassay (bilvosita Elishay)

Bilvosita immunoassay usuli 3 bosqichli jarayonni amalga oshirish bilan tavsiflanadi, uning birinchi bosqichida antigen maxsus tayyorlangan plastmassada adsorbsiyalanadi, ikkinchi bosqichda o'ziga xos antikorlar antigen bilan o'zaro ta'sir qiladi va uchinchi bosqichda antikorlar. -turdagi antikorlar tizimga kiritiladi, indikator fermentativ reaksiyani aniqlaydigan ferment bilan konjugatsiya qilinadi. . Ushbu usulda ferment sifatida horseradish peroksidaza ishlatiladi. Reaksiya maxsus 96 quduqli plastinkalarda olib boriladi.

I. Antigenning sorbsiyasi

Immunoassay uchun 96 quduqli plastinka quduqlarida 100 mkl fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) har bir quduqqa 0,1-0,5 mkg antigen so'riladi. Inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka silkitgichda chayqatiladi. Bog'lanmagan antigen molekulalarini yuvish (2 marta) 0,1% Tween-20 (PBST) ni o'z ichiga olgan fosfat-buferli tuz bilan amalga oshiriladi.

II. blokirovka qilish

O'ziga xos bo'lmagan bog'lanish joylarini blokirovka qilish uchun planshetning quduqlari PBST bilan to'ldiriladi va xona haroratida 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.

III. Maxsus antikorlarni bo'yash

Skrining planshetning gorizontal va vertikal qatorlarida ham amalga oshirilishi mumkin. Shuni ta'kidlash kerakki, antikorlarning trituratsiyasi antikorlarning optimal konsentratsiyasini tanlash yoki titrni aniqlash zarur bo'lganda amalga oshiriladi. Antikorlarning optimal kontsentratsiyasi va / yoki titri aniqlangan taqdirda, ushbu maxsus antikorlar uchun tavsiya etilgan suyultirish qo'llaniladi.

Trituratsiyalashda antikorlarning tayyor suyultirilishi qatorning birinchi qudug'iga kiritiladi - har bir quduqqa o'rtacha 1-10 mkg, so'ngra quduqlarda antikorlarni ketma-ket suyultirish amalga oshiriladi. Maxsus antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka silkitgichda chayqatiladi. Yuvish PBST bilan 3 marta amalga oshiriladi.

IV. Enzim yorlig'i bilan konjugatsiyalangan turlarga qarshi antikorlarning qo'shilishi

Detektor (ikkilamchi) antikorlar sifatida horseradish peroksidaza bilan konjugatsiyalangan turga qarshi poliklonal antikorlar qo'llaniladi. Ko'pincha, butun molekulaga yoki o'ziga xos antikorlarning Fc fragmentlariga xos bo'lgan echki yoki quyon antikorlari qo'llaniladi. Aniqlash antikorlarining konsentratsiyasi odatda ishlab chiqaruvchi tomonidan stok eritmasining suyultirilishi sifatida ko'rsatiladi (masalan, 1:1000). Ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka shakerida silkitiladi. Yuvish PBST bilan 5-6 marta amalga oshiriladi.

Horseradish peroksidaza vodorod periks bilan substrat oksidlanish reaktsiyasini katalizlaydi. O-fenilendiamin (OPD) horseradish peroksidaza uchun substrat sifatida ishlatiladi. Reaksiya natijasida rangli OPD oksidlanish mahsuloti hosil bo'ladi.

Substrat eritmasi: 10 ml substrat buferiga (0,1 M Na-sitrat buferi, pH 4,5) 0,01 ml 30% vodorod periks va 0,2 ml 50x OFD eritmasi qo'shing (10 ml etanolda 340 mg OFD; -20 da saqlang. °C).

Inkubatsiya 10 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka shakerida chayqatiladi.

V. Enzimatik reaksiyani to'xtatish

VI. Optik zichlikni o'lchash

To'g'ridan-to'g'ri ferment immunoassay (to'g'ridan-to'g'ri Elishay)

To'g'ridan-to'g'ri immunoassay usuli bilvosita immunoassay usuli bilan solishtirganda faqat kichik farqlarga ega. Shunday qilib, tahlilning har ikkala turida I va II bosqichlar bir xil. Farq shundaki, III bosqich immunoassayning to'g'ridan-to'g'ri versiyasida ferment yorlig'i bilan konjugatsiyalangan o'ziga xos antikorlar qo'llaniladi. Agar kerak bo'lsa, avvalroq konjugatsiyalanmagan antikorlar uchun tavsiflanganga o'xshab, ferment yorlig'i bilan konjugatsiyalangan o'ziga xos antikorlarning trituratsiyasini ham amalga oshirish mumkin. IV bosqich o'tkazib yuboriladi va keyingi bosqichlar (V-VII) immunoassayning bilvosita varianti uchun yuqorida tavsiflangan tarzda amalga oshiriladi.

Sendvich tipidagi immunoassay

Guruch. 2. "Sendvich" tipidagi immunoassayning sxematik ko'rinishi. ATp - substrat antikori, ATd - aniqlovchi antikor, AG - antijen, M - aniqlovchi antikorga kovalent bog'langan yorliq, P - substrat antikori adsorbsiyalangan substrat.

Immunoassayning ushbu variantida (2-rasm) o'rganilayotgan antigenning fazoviy uzoq epitoplariga xos bo'lgan bir juft antikor ishlatiladi.

I. Antikorlarning substratga sorbsiyasi

Immunoassay uchun 96-quduqli plastinkaning quduqlarida 100 µl fosfat-buferli sho‘r suvda (PBS) 1-2 mkg antikor substrati so‘riladi. Inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka silkitgichda chayqatiladi. Bog'lanmagan antigen molekulalarini yuvish (2 marta) 0,1% Tween-20 (PBST) ni o'z ichiga olgan fosfat-buferli tuz bilan amalga oshiriladi.

II. blokirovka qilish

O'ziga xos bo'lmagan bog'lanish joylarini blokirovka qilish uchun quduqlar PBST bilan to'ldiriladi va xona haroratida 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.

III. Antigen bilan inkubatsiya

Oldindan adsorbsiyalangan antikorlari bo'lgan planshetning quduqlariga 50 mkl sinov eritmasi yoki antigenning standart suyultirilishi qo'shiladi. Antigen suyultirishlari PBST dan tayyorlanishi kerak, chunki Tween-20 oqsil molekulalarining bir-biriga va plastinka yuzasiga o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishini kamaytiradi. Sinov eritmasi ham, antigenning standart suyultirilishi ham har bir oqsilni suyultirish uchun ikkita (uch) quduqdan foydalangan holda juft (yoki 3 marta) qo'shiladi. Inkubatsiya xona haroratida 30 daqiqa davomida doimiy aralashtirish bilan amalga oshiriladi. Yuvish PBST eritmasi bilan 3 marta amalga oshiriladi.

IV. Ferment bilan belgilangan antikorlar bilan inkubatsiya

Tabletka quduqlariga ferment yorlig'i bilan konjugatsiyalangan o'ziga xos antikorlarning 100 mkl eritmasi qo'shiladi. Konjugatsiyalangan antikorlarning optimal kontsentratsiyasi odatda ishlab chiqaruvchi tomonidan belgilanadi (odatda 2-4 mkg / ml konsentratsiya ishlatiladi). Ferment yorlig'ini o'z ichiga olgan antikorlar bilan inkubatsiya 30 daqiqa davomida xona haroratida va gorizontal plastinka shakerida silkitiladi. Yuvish PBST bilan 5-6 marta amalga oshiriladi.

V. Rangli mahsulot paydo bo'lishi bilan birga fermentativ reaktsiyani o'tkazish

Quduqlarga 100 mkl substrat eritmasi qo'shiladi va doimiy aralashtirish bilan xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.

VI. Enzimatik reaktsiyani to'xtatish

Optik zichlikni o'lchashdan oldin rang reaktsiyasi 0,5 M H 2 SO 4 bilan to'xtatiladi. Inkubatsiyadan keyin 50 mkl 0,5 M sulfat kislota eritmasi OFD ishchi eritmasi bilan quduqlarga qo'shiladi. Shundan so'ng, siz darhol optik zichlikni o'lchashni boshlashingiz mumkin.

VII. Optik zichlikni o'lchash

Rangli mahsulot eritmasining optik zichligi plastinkali spektrofotometr yordamida l=490 nm da o‘lchanadi.

Standartlar ro'yxatida diagnostika choralari yuqumli kasalliklar uchun ishlatiladigan ferment immunoassay o'z ichiga oladi. Sifilis uchun Elishay ijobiy bo'lsa, darhol vahima qo'ymang.

Keling, ushbu tadqiqot metodologiyasining xususiyatlarini va olingan natijalarni ochish tamoyillarini batafsil ko'rib chiqaylik. turli toifalar bemorlar.

Enzim immunoassay yuqumli kasalliklarni tashxislashning eng keng tarqalgan usullaridan biridir. U treponemal testlar toifasiga kiradi, ya'ni bemorning tanasida sifilis qo'zg'atuvchisi - rangpar treponema mavjudligini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.

Elishay tomonidan sifilis treponemaga antikorlarni aniqlash tufayli aniqlanadi. Ular bemorning qonida mavjud bo'lib, ularning turi va miqdori kasallikning bosqichi va shakliga bog'liq bo'lib, bu sizga olish imkonini beradi. muhim ma'lumotlar inson salomatligining hozirgi holati haqida.

Afzalliklari va kamchiliklari

Elishay ko'pincha sifilis yoki boshqa shubhalar uchun buyuriladi yuqumli kasalliklar. Buning sababi, tahlil kasallikning aniq turini va bosqichini aniqlash imkonini beradi va uning ishonchliligi yuqori darajada qolmoqda - bir nechta tadqiqotlar natijalariga ko'ra xato ehtimoli bor-yo'g'i 1% ni tashkil qiladi, asosiy Elishay. taxminan 90% aniqlikka ega.

Yuqori sifatli reagentlar va zamonaviy uskunalardan foydalanish ko'rsatkichlarning aniqligini maksimal darajada oshirish imkonini beradi.

Umuman olganda, usulning afzalliklari quyidagilardan iborat:

1. Natijaning yuqori aniqligi. Noto'g'ri ma'lumotlarni olish ehtimoli juda kichik.
2. Inson ta'sir omilini minimallashtirish. Elishayni o'tkazish uchun zamonaviy uskunalar jarayonni avtomatlashtirish tufayli insonning tadqiqot natijalariga ta'sirini istisno qiladi.
3. Maxsus antikorlarni aniqlash. Bir turdagi antijenlarni boshqalar bilan aralashtirib yuborish mumkin emas, shuning uchun tahlil aniq tashxis uchun aniq natijani ko'rsatadi.
4. Normdan eng kichik og'ishlarni tuzatish. Patologik agentlarning eng kichik kontsentratsiyasi ham e'tibordan chetda qolmaydi.

Ushbu usulning kamchiliklari haqida unutmang. ELISA quyidagi kamchiliklarga ega:

1. Yuqori narx. Yuqori narx ko'plab omillarga, xususan, yaxshi jihozlarga, yuqori sifatli reagentlarga va etarli darajadagi tayyorgarlikka ega bo'lgan mutaxassislarga bo'lgan ehtiyoj bilan bog'liq.
2. Dastlabki tashxis qo'yish zarurati. Qaysi antijenlarni izlash kerakligini bilishingiz kerak, chunki qo'shimcha ma'lumotlarsiz aniq tashxis qo'yish mumkin bo'lmaydi.
3. Noto'g'ri ijobiy natija ehtimoli. Ba'zi tana sharoitlari va boshqa omillar yakuniy ma'lumotlarni buzishi mumkin.

Amalga oshirish uchun ko'rsatmalar

Shifokor nafaqat sifilizni, balki bir qator boshqa yuqumli kasalliklarni ham tashxislash uchun ferment immunoassayni buyurishi mumkin.

Agar biz treponema infektsiyasi bilan bog'liq vaziyatni to'g'ridan-to'g'ri ko'rib chiqsak, tekshirishning sababi bo'lishi mumkin:

• kasallikning tashqi belgilarining paydo bo'lishi (shankr, sifilitik toshma, gumma va boshqalar);
• immunitetning sezilarli darajada pasayishi;
• jinsiy sherik, qarindoshlar va oila a'zolarida sifilisni aniqlash yoki shubha qilish;
• boshqa testlar paytida ijobiy reaktsiya;
• sifilis bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan boshqa kasalliklarni aniqlash;
• shaxsning tekshirilishiga bo'lgan shaxsiy xohishi.

Amalga oshirish usullari

Elishay amalga oshirilishi mumkin turli yo'llar bilan. Har bir holatda, eng mos variant tanlanadi.

Avvalo, usullarni quyidagilarga bo'lish mumkin:

1. Sifatli. Bemorning tanasida infektsiya yoki virus mavjudligi aniqlanadi.
2. Miqdoriy. Inson tanasida patogen agentga antikorlarning kontsentratsiyasini aniqlaydi, bu kasallikning rivojlanish bosqichini va intensivligini ko'rsatadi.

Kerakli reaktsiyani takrorlash printsipiga ko'ra Elishay o'tkazish usullarining tasnifi ham mavjud.

3 ta variant mavjud:

1. Streyt. Belgilangan antikorlar taqdim etilgan qon namunalariga AOK qilinadi.
2. Antijenler bilan bilvosita. Adsorbsiyalangan antijenler Elishay uchun mo'ljallangan polistirol plitasining hujayralariga oldindan joylashtiriladi. Keyin ularga viruslarning antikorlari qo'shiladi, bu natijalarni keyingi baholash uchun zarur bo'lgan immun komplekslarning shakllanishiga olib keladi.
3. Antikorlar bilan bilvosita. Jinsiy yo'l bilan yuqadigan kasalliklar uchun bu usul ko'pincha qo'llaniladi. Bu antikorlarning dastlabki sorbsiyasini o'z ichiga oladi, shundan keyingina plastinkaga antijenler qo'shiladi.

Materiallardan namuna olish qoidalari

Noto'g'ri natijalarni olish xavfini kamaytirish uchun tahlil qilish uchun qonni to'g'ri topshirish kerak.

Elishaydan o'tishdan oldin ba'zi cheklovlarga rioya qilish kerak:

• kuchli jismoniy va hissiy stressdan saqlaning;
• kamida 1-3 kun oldin chekish va spirtli ichimliklarni iste'mol qilishni to'xtatish;
• bir necha kun davomida siz to'g'ri ovqatlanishga o'tishingiz kerak;
• ayollar uchun hayz davrining fazasini nazorat qilish tavsiya etiladi, chunki gormonlar natijalarni buzishi mumkin;
• oxirgi ovqat qon topshirishdan 8-10 soat oldin bo'lishi kerak;
• 10 kun davomida tadqiqot natijalariga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan dori-darmonlar chiqarib tashlanadi.

ELISA uchun venoz qon kubital venadan olinadi, uni ertalab bo'sh qoringa olish kerak. Umuman olganda, venoz qon namunalarini olishga tayyorgarlik ko'rishning standart qoidalari qo'llaniladi. Qaysi kasallik tekshirilayotganiga qarab, qo'shimcha talablar qo'llanilishi mumkin. dastlabki tayyorgarlik sabr.

Metodologiya

Elishayni o'tkazish bo'yicha ko'rsatmalar juda oddiy:

1. Bemor venadan qon oladi.
2. Olingan material tayyorlanmoqda va maxsus nozik to'rli palitrada namunalarga bo'linadi.
3. Tanlangan usul bo'yicha antijenler antikorlar bilan aralashtiriladi.
4. Reaktsiya baholanadi. Namunalar nazorat namunalari bilan taqqoslanadi, natijalarni sifat va miqdoriy baholash amalga oshiriladi.
5. Ma'lumotlar miqdoriy ko'rsatkichlar (jami antikorlar) qo'llanilishi bilan maxsus jadvalga kiritiladi.
6. Davolovchi shifokor natijalarni hal qiladi. Agar kerak bo'lsa, tegishli davolanish belgilanadi.

Tekshiruvdan so'ng bemorga natijalar bilan hujjat beriladi. U yuqumli kasalliklar nomlari bilan kesishgan joyda immunoglobulinlarning har bir turiga qarama-qarshi bo'lgan tegishli belgilarga ega jadval shakliga ega.

Shifrni ochish

Faqatgina mutaxassis tahlil natijalarini to'g'ri hal qila oladi. O'z-o'zidan aniqlash qiyin, masalan, ELISA k = 1 4 natijasi nimani anglatadi.Sifilis ham turli shakllarda paydo bo'lishi mumkin, bu ham yakuniy ma'lumotlarga ta'sir qiladi.

Natijalar immunoglobulinlarning 3 turini ko'rsatadi:

1. IgM. Sifilis bilan kasallanish davrini aniqlashga ruxsat bering. Ijobiy natija kasallikning kuchayishini ko'rsatadi. Ularning yo'qligi surunkali patologiyalarning remissiyasini yoki kasallikning yashirin shaklini ko'rsatishi mumkin.
2. IgA. Infektsiyadan keyin bir oydan ortiq vaqt o'tgan kasallikni ko'rsatadi. Bu, shuningdek, oddiy patologiyalar va surunkali surunkali kasalliklar bilan kasallikning o'tkir bosqichining belgisidir.
3. IgG. Bu kasallikning eng yuqori davrining belgisi, ya'ni uning kuchayishi. Sifilis bilan davolanishdan keyin bir muncha vaqt o'tgach, ijobiy reaktsiya paydo bo'ladi. Kasallikning ayrim turlarida bu rivojlangan immunitet belgisi bo'lishi mumkin.

Ushbu moddalar organizm tomonidan ma'lum bir ketma-ketlikda ishlab chiqariladi, bu kasallikning qo'shimcha belgisidir. Sifatli testlar bilan har bir turdagi qonda faqat immunoglobulinlar mavjudligi aniqlanadi.

Bu tahlilga jalb qilingan materiallar rangining o'zgarishida ifodalanadi. Miqdoriy ko'rsatkichlar yordamchi bo'lib, ular vaziyatni aniqroq tasvirlaydi. Antijenler va antikorlarning nisbati kasallikning og'irligini va tananing javob intensivligini ko'rsatadi.

Nima qilish kerak

Agar bemorda haqiqatan ham sifilis bo'lsa, ijobiy ELISA mutlaqo har doim aniqlanadi, bunday tadqiqotda treponemalarning mavjudligini sezmaslik mumkin emas. Umidsizlikka tushmang, kasallik davolanishga yaxshi javob beradi, ayniqsa dastlabki bosqichlarda.

Sinov natijasi ijobiy bo'lsa nima qilish kerak:

• shifokor ko'rsatmasi bo'yicha qo'shimcha tekshiruvlardan o'tish;
• tanlangan sxema bo'yicha antibiotik terapiyasi kursini o'ting;
• immunitet tizimini mustahkamlashga e'tibor berish;
• jinsiy sherigingizga kasallik haqida xabar bering;
• kelajakda dispanserda ro'yxatdan chiqarilgunga qadar (musbat test natijalari bo'lmaganda 5 yildan keyin) muntazam ravishda profilaktik diagnostikadan o'ting.

Kasallik ta'tilini kechiktirish va natijalarni e'lon qilishdan qo'rqishning hojati yo'q. Tashxis shifrlangan va sir bo'lib qoladi, faqat boshqa odamlarga infektsiya xavfi mavjud bo'lsa, qarindoshlari va jinsiy sherigiga muammo haqida xabar berish kerak, shunda ular kerakli tekshiruvlardan o'tadilar.

Noto'g'ri ijobiy natija va uning sabablari

Ba'zida boshqa testlarning natijasi qayd etiladi va Elishay sifilis uchun noto'g'ri ijobiydir. Shuning uchun 2 - 3 ni bajarish tavsiya etiladi yordamchi usullar va bir muncha vaqt o'tgach, ferment immunoassayni takrorlang.

Bunday noaniqliklar kamdan-kam uchraydi, ular asosan quyidagi omillarga bog'liq:

• homiladorlik;
• surunkali kasalliklar;
• yaqinda emlash;
• jarohat.

Noto'g'ri ijobiy natijalar ularni qo'zg'atgan omilning tabiatiga qarab o'tkir va surunkali bo'linadi.

Ularning asosiylari jadvalda keltirilgan:

Ushbu sog'liq muammolari uchun sifilis testi ko'rsatilishi mumkin ijobiy natija, ammo bu faqat kasallik bilan kurashish uchun tananing oqsillarni ishlab chiqarishining natijasidir. Biroq, Elishay ularni antijenler sifatida taniydi.

Bir yarim yoshgacha bo'lgan sog'lom bola, agar ayol homiladorlik paytida sifilis bilan kasallangan bo'lsa, Elishayning noto'g'ri ijobiy natijalariga duch kelishi mumkin. Bu yoshdan oldin qon hali o'zini to'liq yangilash uchun vaqtga ega emas, shuning uchun onaning antikorlari unda mavjud bo'lishi mumkin. Istisno - IgM immunoglobulinlarini aniqlash bilan bog'liq vaziyat.

Ushbu maqoladagi videoni tomosha qilib, ferment immunoassay xususiyatlari va uning metodologiyasi haqida ko'proq bilib olishingiz mumkin.